急性缺氧條件下乳鼠心肌細(xì)胞TNFR1表達(dá)特點(diǎn)及siRNA調(diào)控作用.pdf

1、第一部分急性缺氧條件下乳鼠心肌細(xì)胞TNFR1表達(dá)特點(diǎn)
　　目的：探討急性缺氧條件下,乳鼠心肌細(xì)胞(NRCM)腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)表達(dá)變化情況。
　　方法及結(jié)果：培養(yǎng)原代乳鼠心肌細(xì)胞,應(yīng)用Na2S2O4作為氧清除劑,模擬單個(gè)心肌細(xì)胞缺氧模型;根據(jù)血?dú)夥治鼋Y(jié)果,在培養(yǎng)基中加入不同濃度的Na2S2O4,造成心肌細(xì)胞輕、中、重度不同程度缺氧,利用RT-PCR、Western-blot和confocal分別檢測(cè)心肌細(xì)胞TN

2、FR1的表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示,在缺氧急性期(3h內(nèi)),隨著缺氧程度的加重和缺氧時(shí)間的延長,心肌細(xì)胞TNFR1表達(dá)減少,且重度缺氧早期即可出現(xiàn)TNFR1表達(dá)明顯減少,而輕度缺氧時(shí),TNFR1表達(dá)量下降相對(duì)緩慢。
　　結(jié)論：在急性缺氧條件下(缺氧3h內(nèi)),乳鼠心肌細(xì)胞TNFR1表達(dá)減少。
　　第二部分小分子干擾RNA抑制乳鼠心肌細(xì)胞TNFR1的表達(dá)
　　目的：研究siRNA對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞(NRCM)腫瘤壞死因子受體1(T

3、NFR1)基因沉默作用。
　　方法及結(jié)果：根據(jù)大鼠基因序列設(shè)計(jì),化學(xué)合成3條干擾TNFR1基因的siRNA及1條陰性對(duì)照siRNA,以Cy3熒光標(biāo)記,以Lipofectamine2000(Invitrogen,美國)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染NRCM,用RT-PCR和Western-blot分別檢測(cè)TNFR1基因在mRNA和蛋白水平的改變,驗(yàn)證所設(shè)計(jì)的siRNA的抑制效應(yīng)。以Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染NRCM,轉(zhuǎn)染效率大于30％。起