探討p38MAPK信號通路對樹突狀細胞PD-L1表型的影響.pdf

1、研究背景:
　　 冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┮呀?jīng)成為威脅人類健康的第三位殺手，也是嚴重影響人們生活質(zhì)量的最常見的心血管疾病之一。研究表明冠心病是慢性炎癥反應(yīng)，動脈粥樣斑塊內(nèi)有大量的單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和T淋巴細胞等炎癥細胞的浸潤，斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)非?；钴S;而活動性炎癥反應(yīng)可促使穩(wěn)定性粥樣斑塊轉(zhuǎn)變?yōu)椴环€(wěn)定性斑塊，這是冠狀動脈內(nèi)急性血栓形成的誘因。由此可見，抑制炎癥細胞活性，阻斷炎癥反應(yīng)通路已成為研究冠心病免疫治療的

2、熱點和難點。眾所周知，T淋巴細胞的激活是炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，而近年來發(fā)現(xiàn)的負性刺激信號（PD-1/PD-L1）對調(diào)節(jié)T淋巴細胞活性起重要作用。
　　 程序性死亡因子配體1(programmedcelldeathligand1，PD-L1、B7-H1或CD274)是由290個氨基酸構(gòu)成的Ⅰ型跨膜蛋白。早在1999年Dong等研究指出PD-L1是B7家族分子的第三位成員，它的受體既不是CD28蛋白，也不是CTLA-4蛋白（cytot

3、oxicT-lymphocyteAntigen4，CTLA-4）和ICOS蛋白(inducibleco-stimulator，ICOS)，其受體為程序性死亡因子1(programmedcelldeath1receptor，PD-1或CD279)。由于最初在腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)PD-L1有高表達，人們因此推測PD-L1可能與腫瘤細胞浸潤有關(guān);但隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)除腫瘤細胞以外，PD-L1在多種炎癥細胞和組織細胞上均有表達，如T淋巴細胞、B淋巴細

4、胞、巨噬細胞、Kupffer細胞、星形細胞、樹突狀細胞、血管內(nèi)皮細胞、骨髓源性肥大細胞、胎盤合體滋養(yǎng)層細胞等等;PD-L1的功能除與腫瘤細胞浸潤以外，還與多種疾病發(fā)生有密切的關(guān)系，如移植免疫反應(yīng)、自身免疫性疾病、微生物感染（病毒感染）。近年來研究還發(fā)現(xiàn)PD-L1/PD-1與動脈粥樣斑塊形成有關(guān)。Gotsman等研究冠狀動脈斑塊時，發(fā)現(xiàn)用熒光免疫技術(shù)可以探測到PD-L1可表達于多處動脈粥樣斑塊內(nèi)。Lee等發(fā)現(xiàn)冠心病患者外周血T淋巴細胞PD

5、-1表型及樹突狀細胞PD-L1表型均較健康人的明顯降低，而冠心病患者樹突狀細胞激活初始T淋巴細胞能力明顯增強。雖然現(xiàn)在對PD-L1的功能有了一定了解，然而到現(xiàn)在促使細胞表達PD-L1蛋白的分子機制還沒有完全清晰。不同研究對象及使用不同刺激物，得出結(jié)果不完全相同，歸納起來影響PD-L1表達的細胞信號通路可能為JAK/STAT信號通路、PI3K/Akt信號通路、MEK/Erk信號通路、NPM/ALK通路，以及與IRF-1和STAT-3轉(zhuǎn)錄因

6、子有關(guān)。眾所周知，p38MAPK信號通路是MAPK通路的重要分支，它通過使轉(zhuǎn)錄因子磷酸化而改變基因的表達，參與多種細胞內(nèi)信息傳遞過程，能對廣泛的細胞外信號發(fā)生反應(yīng)，介導(dǎo)細胞生長、發(fā)育、分化及死亡全過程。然而關(guān)于PD-L1蛋白表達與p38MAPK信號通路的關(guān)系的研究資料甚少。
　　 鑒于以上證據(jù)，本課題以體外培養(yǎng)單核細胞源樹突狀細胞作為研究對象，利用炎癥因子(LPS)刺激樹突狀細胞模擬病原微生物入侵的模型，觀察樹突狀細胞PD-L1

7、表型的變化;再以p38蛋白特異性抑制劑SB203580阻斷p38MAPK通路，探討樹突狀細胞表達PD-L1與p38MAPK信號通路的關(guān)系，闡明LPS誘導(dǎo)樹突狀細胞表達PD-L1蛋白的分子機制，完善負性協(xié)同刺激信號(PD-1/PD-L)調(diào)控T淋巴細胞活性的機理，為動脈粥樣硬化的免疫治療的提供理論基礎(chǔ)。
　　 第一部分:脂多糖誘導(dǎo)單核細胞源樹突狀細胞表達PD-L1
　　 目的:觀察炎癥因子(LPS)對樹突狀細胞CD80、CD

8、86和PD-L1表型的影響，以明確LPS能夠促進樹突狀細胞成熟，增強PD-L1表達的作用。
　　 對象和方法:
　　 1、對象體外培養(yǎng)健康人外周血單核細胞來源的樹突狀細胞
　　 2、方法
　　 2、1.單核細胞的分離和培養(yǎng)
　　 采用密度離心法分離健康人外周血單個核細胞，加入含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，調(diào)整細胞密度為5×106/ml，接

9、種于六孔細胞培養(yǎng)板中，置入飽和濕度、5％CO237℃的細胞孵育箱中培養(yǎng)2小時。取出六孔細胞培養(yǎng)板，吸棄懸浮細胞，即得貼壁的單核細胞。
　　 2、2.樹突狀細胞的誘導(dǎo)和培養(yǎng)
　　 貼壁的單核細胞用無Ca2+、Mg2+的PBS輕柔洗2次后，在每個孔加入含rhGM-CSF25ng/ml、rhIL-425ng/ml、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的樹突狀細胞完全培養(yǎng)基約3ml，置于5％CO237℃的孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)

10、，分別于第3、5天半量換液，補充細胞因子，維持rhGM-CSF和rhIL-4均為25ng/ml。于第7天收獲樹突狀細胞。
　　 2、3.實驗分組（每組設(shè)2個復(fù)孔，共實驗4次）LPS用二甲基亞砜(DMSO)溶解。
　　 根據(jù)使用是否使用脂多糖，將實驗分為兩組:LPS組(LPS)和對照組(NORMAL)。LPS組:樹突狀細胞給予LPS(1.0μg/ml)處理后繼續(xù)培養(yǎng)24小時;對照組:樹突狀細胞給予DMSO(0.1％V/V)

11、處理后繼續(xù)培養(yǎng)24小時。
　　 2、4.流式細胞術(shù)檢測細胞表型
　　 收集各組樹突狀細胞，調(diào)整細胞濃度為5×105/ml，分別加入相關(guān)表型抗體，孵育，清洗2次，用流式細胞儀檢測相關(guān)表型熒光強度，用Cellquest分析檢測結(jié)果。
　　 3、統(tǒng)計學(xué)方法:
　　 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件處理，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（-x±S)表示，統(tǒng)計學(xué)分析采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

12、r>　　 結(jié)果:
　　 1、樹突狀細胞形態(tài)學(xué)觀察
　　 倒置顯微鏡下觀察，外周血單核細胞經(jīng)rhGM-CSF和rhIL-4聯(lián)合誘導(dǎo)7天，細胞聚集呈克隆分布，體積較大，呈圓形或形狀不規(guī)則，并有毛刺狀突起，為典型樹突狀細胞形態(tài)。LPS組細胞經(jīng)LPS刺激6小時后貼壁牢固，偽足變?yōu)榧氶L，細胞呈梭形;刺激至24小時細胞逐漸恢復(fù)圓形，偽足逐漸變短。對照組樹突狀細胞呈圓形，懸浮生長，偽足較多。
　　 2、流式結(jié)果:
　　

13、 LPS組樹突狀細胞CD80表型(1492.46±82.65)、CD86表型(1136.73±81.62)和PD-L1表型(3665.89±261.66)較對照組的(536.52±64.10，518.47±48.91，1093.38±115.54)均明顯增高，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均小于0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、脂多糖能夠促使樹突狀細胞CD80和CD86表達增高，促進樹突狀細胞成熟。
　　 2、

14、脂多糖能夠誘導(dǎo)樹突狀細胞PD-L1表達增高。
　　 第二部分:p38MAPK通路調(diào)控單核細胞源樹突狀細胞表達PD-L1
　　 目的:以p38蛋白特異性抑制劑SB203580阻斷p38MAPK信號通路后，觀察樹突狀細胞受炎癥因子刺激后PD-L1表型變化，探討樹突狀細胞表達PD-L1與p38MAPK信號通路的關(guān)系。
　　 對象和方法:
　　 1、對象體外培養(yǎng)健康人外周血單核細胞來源的樹突狀細胞。
　　

15、 2、方法
　　 2、1.單核細胞的分離和培養(yǎng):同第一部分。
　　 2、2.樹突狀細胞的誘導(dǎo)和培養(yǎng):同第一部分。
　　 2、3.實驗分組（每組設(shè)2個復(fù)孔，重復(fù)實驗4次）
　　 收獲未成熟的樹突狀細胞，調(diào)整細胞密度為2×106/ml，接種于6孔培養(yǎng)板中。根據(jù)是否使用LPS和p38蛋白特異性抑制劑SB203580將實驗分成三組:LPS及SB203580均用二甲基亞砜(DMSO)溶解
　　 第一組為LP

16、S刺激組(LPS):首先在實驗細胞中加入DMSO(0.1％V/V)作用1小時，再加入LPS(1.0μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)24小時;
　　 第二組為SB203580和LPS共刺激組(SB):首先在實驗細胞中加入SB203580(25μM)作用1小時，再加入LPS(1.0μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)24小時;
　　 第三組為正常組(NORMAL):將未加入任何藥物的細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時作為陰性對照。
　　 2、4.流式細胞術(shù)檢

17、測細胞表型:同第一部分。
　　 2、5.Westernblot檢測PD-L1蛋白
　　 收獲各組細胞，提取蛋白，調(diào)節(jié)上樣量為30μg總蛋白/個樣品，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，加入一抗、二抗，洗膜，染色，曝光，用Gelpro32分析膠片中蛋白條帶。
　　 3.統(tǒng)計學(xué)方法
　　 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件處理，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(-x±S)表示，統(tǒng)計學(xué)分析多樣本比較采用單因素方差分析(one-wayANOV

18、A)，多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、樹突狀細胞形態(tài)學(xué)改變
　　 倒置顯微鏡下觀察，1）LPS組樹突狀細胞經(jīng)LPS刺激6小時后貼壁牢固，偽足變?yōu)榧氶L，細胞呈梭形;刺激24小時后細胞逐漸恢復(fù)圓形，偽足逐漸變短。2)SB組樹突狀細胞分散，偽足變短或者退化。3）正常組樹突狀細胞仍舊呈圓形，懸浮生長，偽足較短。
　　 2、細胞表型變化
　　 1)比較

19、三組細胞CD11c平均熒光強度總體均數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（LPS組:628.19±34.99，SB組:617.44±41.00，正常組:589.68±47.84，P=1.825,P=0.186)。
　　 2)比較三組樹突狀細胞CD86表型平均熒光強度，三組總體均數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=16.958，P＜0.01），用SNK-q檢驗進行兩兩比較，SB組CD86表型與LPS組的相比明顯降低（729.49±48.89vs873.01±7

20、1.24，P＜0.05），與正常組的相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（vs736.96±42.11，P＞0.05），LPS組CD86表型平均熒光強度顯著高于正常組的（P＜0.05）。
　　 3)比較三組PD-L1表型平均熒光強度總體方差不齊，經(jīng)log10轉(zhuǎn)換后符合方差齊性檢驗（P=0.152，P=0.86）。分析三組總體均數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=82.162，P＜0.01)。兩兩比較分析，SB組PD-L1表型平均熒光強度(3.03±0.08

21、)明顯低于其它兩組，與LPS組的相比，P＜0.01(vs3.51±0.08);與正常組的相比，P＜0.05(vs3.18±0.07)。LPS組PD-L1表型平均熒光強度明顯高于正常組的（P＜0.05）。
　　 3、Westernblot檢測PD-L1蛋白
　　 三組總體方差符合方差齊性檢驗(P=1.427，P=0.262)，三組間均數(shù)總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=75.226，P＜0.01）;比較組間差異，SB組樹突狀細胞的

22、PD-L1蛋白含量(0.55±0.08)明顯低于其余兩組的，與LPS組的相比，P＜0.05(vs1.24±0.11);與正常組的相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（vs0.95±0.14，P＜0.05）;LPS組細胞PD-L1蛋白含量高于與正常組(P＜0.05)
　　 結(jié)論:
　　 1、抑制p38蛋白后阻斷脂多糖的促進樹突狀細胞成熟作用，說明p38MAPK通路調(diào)控樹突狀細胞成熟。
　　 2、抑制p38蛋白后阻斷PD-L1表達增