P-ezrin通過p38MAPK信號通路介導(dǎo)乳腺癌轉(zhuǎn)移.pdf

1、埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白(Ezrin-Radixin-Moesin，ERM)蛋白家族通過組成膜細(xì)胞骨架相關(guān)復(fù)合體和特殊膜結(jié)構(gòu)對細(xì)胞活動進(jìn)行調(diào)節(jié)，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起了重要的作用。細(xì)胞骨架連接蛋白ezrin屬于ERM家族成員之一，定位于6q25.2-6q26編碼基因為villin2。新近研究發(fā)現(xiàn)ezrin高表達(dá)與多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)ezrin通過N端與C端相互作用，形成頭尾連接的折疊狀態(tài)遮蔽了分子表面的結(jié)合位點，處于失

2、活狀態(tài)。Fievet等發(fā)現(xiàn)Thr567磷酸化和PIP2共同參與ezrin活化，活化的ezrin通過連接F-肌動蛋白絲與胞膜的CD44，E-鈣黏附蛋白(E-cadherin)，細(xì)胞間黏附分子1/2(Intercellular adhesion molecule1/2，ICAM1/2)等發(fā)揮功能。 探討ezrin上下游調(diào)控分子，這些與調(diào)控有關(guān)的分子將會成為治療腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated P

3、rotein Kinase，MAPK)是細(xì)胞的主要信號傳導(dǎo)系統(tǒng)之一，p38MAPK屬于MAPK的一個亞族，它通過磷酸化作用改變下游因子的表達(dá)，參與多種胞內(nèi)信息傳遞過程。多種生長因子、炎癥因子和應(yīng)激反應(yīng)可激活p38MAPK，p38MAPK激活后可使多種轉(zhuǎn)錄因子活化，影響基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成，細(xì)胞能動性和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變，在細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移方面具有重要的調(diào)控功能。綜上p38和ezrin只有都磷酸化后才能行使后續(xù)功能，目前關(guān)于p-p38，p-ez

4、rin兩者在介導(dǎo)乳腺癌轉(zhuǎn)移方面的研究，國內(nèi)外鮮有報道。 Mengdong Lan等研究發(fā)現(xiàn)小鼠永生性肝細(xì)胞系中ezrin蛋白通p38MAPK信號通路的磷酸化參與微絨毛的形成，這說明p38與ezrin可能存在著一定的聯(lián)系，但是作者認(rèn)為：1：轉(zhuǎn)染raf-1基因的小鼠肝細(xì)胞中snail表達(dá)上調(diào)E-caherin，ezrin表達(dá)下調(diào)，微絨毛縮短，小鼠肝細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)，細(xì)胞間黏附變?nèi)醵装l(fā)生轉(zhuǎn)移。2：加入p38抑制劑SB203580

5、后，ezrin，p-ezrin，E-cadherin表達(dá)上調(diào)，微絨毛變長變粗，而snail表達(dá)下調(diào)，不易發(fā)生轉(zhuǎn)移。然而我們認(rèn)為：p38MAPK信號通路可能參與ezrin C端(Thr567)的磷酸化，使p-ezrin上調(diào)，微絨毛變長變粗，從而增強(qiáng)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力。為此本實驗在回顧乳腺癌中p-ezrin和p-p38表達(dá)的基礎(chǔ)上，著重研究兩者在乳腺癌細(xì)胞系中的關(guān)系。探討p38MAPK通路是否參與ezrin C端(Thr567)的磷酸化，影

6、響p-ezrin蛋白表達(dá)，微絨毛的形成。為乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的治療提供新的理論依據(jù)。 材料和方法： 1、材料 (1)臨床資料80例乳腺癌組織，取自于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2001年1月至2007年5月手術(shù)切除標(biāo)本。所有患者術(shù)前未經(jīng)任何治療。80例均為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(IDC)，TNM分期Ⅰ-Ⅱ期51例，Ⅲ-Ⅳ期29例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例；收集50例外科手術(shù)切除新鮮乳腺組織標(biāo)本，標(biāo)本取出后立即置-70℃冰凍保存。其中

7、30例為IDC，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為13例，20例為乳腺纖維腺瘤。 (2)細(xì)胞系三種人乳腺細(xì)胞系(MCF-10A為乳腺正常上皮細(xì)胞系，MCF-7為低侵襲低轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞系，MDA-MB-435s為高侵襲高轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞系)原購自北京協(xié)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心，本實驗由中國醫(yī)科大學(xué)已有的細(xì)胞復(fù)蘇而得。 (3)主要試劑抗人p-p38單克隆抗體(＃9216)和兔抗人p-ezrin單克隆抗體(＃3149)購自Cell signaling公司。p3

8、8MAPK特異性抑制劑SB203580(＃559398)購自美國Calbiochem公司，于-20℃保存待用。異硫氰四甲基羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(TRITC-Phalloidin)購自Sigma公司，Transwell小室(孔徑8um)購自Coming公司。 2、方法 (1)免疫組織化學(xué)技術(shù)80例標(biāo)本經(jīng)10％中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法(Streptavidin-p

9、eroxidase，S-P)按說明書行免疫組化染色。p-p38稀釋比例為1:200，p-ezrin稀釋比例為1:50；以PBS代替-抗作陰性對照，用已知陽性乳腺癌切片作陽性對照。 (2) Westem blot技術(shù)總蛋白從組織、生長到對數(shù)期收集的細(xì)胞及不同濃度的SB203580(0、5、10、20umol/L)處理24小時后的435s細(xì)胞中提取。用Bradford法測定蛋白濃度。取等量蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE和轉(zhuǎn)印，分別孵育一

10、抗(p-p381:400，p-ezrin1:400稀釋)4℃過夜，相應(yīng)二抗(1:4000)37℃孵育，ECL發(fā)光，拍照。用表達(dá)p-p38的PVDF膜剝脫后重新孵育獲得β-actin抗體作為內(nèi)參。 (3)細(xì)胞免疫熒光染色取對數(shù)生長435s細(xì)胞，接種到24孔板中，4％多聚甲醛固定30min，1％TritonX-100增加細(xì)胞膜的通透性，BSA封閉后，分別加入一抗p-p38(1:100)，p-ezrin(1:100)，4℃過夜，避光加

11、入相應(yīng)FITC標(biāo)記二抗(1:50)，同時加入異硫氰四甲基羅丹明(TRITC)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(1:50)，30分鐘后，避光加入Hoechest(1:100)37℃復(fù)染細(xì)胞核。熒光顯微鏡(BX60，OLYMPUS)觀察成像。 (4)掃描電鏡取對數(shù)生長細(xì)胞，消化后接種到蓋玻片上，用不同濃度的SB203580(0、5、10、20umol/L)處理435s，24小時后，加2％戊二醛+2％甲醛固定24小時，1％鋨酸固定1.5小時，梯度酒精脫

12、水，醋酸異戊酯置換，CO2臨界點干燥，真金噴鍍，掃描電鏡(日本JEOL SEM-T300)觀察并攝片。 (5) Transwell上室加入1:6Matrigel膠制成的人工基底膜后接種總體積200ul435s細(xì)胞，并加入終濃度分別為0、5、10、20umol/LSB203580。每個藥物濃度做3復(fù)孔，37℃培養(yǎng)24h后觀察。擦掉基底膜上室面的細(xì)胞，下室細(xì)胞固定后Giemsa染色。400×光鏡下隨機(jī)選擇30個視野計數(shù)，取其平均數(shù)為

13、穿膜細(xì)胞數(shù)。 3、統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件行數(shù)據(jù)處理：采用X2檢驗(不滿條件時用Fisher確切概率法)分析各組計數(shù)資料，采用Spearman等級相關(guān)分析p-p38蛋白與p-ezrin蛋白表達(dá)的關(guān)系，采用t檢驗分析Westem blot圖像灰度值，transwell穿膜細(xì)胞數(shù)，用LSD-t檢驗對各樣本均數(shù)行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1、p-p38、p-ezrin在

14、乳腺癌組織中的表達(dá)及其同臨床病理關(guān)系 (1)免疫組化結(jié)果顯示：p-p38在80例IDC組織中陽性表達(dá)49例(61.3％)，主要定位于細(xì)胞核，少量定位于細(xì)胞漿。p-ezrin陽性表達(dá)34例(42.5％)，定位于細(xì)胞膜，少量定位于細(xì)胞漿。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，p-p38蛋白表達(dá)和p-ezrin蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.269，P=0.016)。兩者表達(dá)水平均與IDC的TNM分期(P=0.012，P=0.002)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(P=0.0

15、15，P=0.001)相關(guān)，而與患者年齡(P=0.580，P=0.670)，腫瘤大小(P=0.107，P=0.142)無明顯相關(guān)性。 (2) Western blot結(jié)果顯示：參照DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，可見在43，80KD附近有特異性條帶，對應(yīng)位置分別為p-p38，p-EzrinThr(567)/Radixin(Thr564)，統(tǒng)計結(jié)果顯示：p-p38，p-ezrin在IDC中的表達(dá)高于乳腺纖維腺瘤組(P=0.015，P=0.000

16、)，兩者的表達(dá)水平在Ⅲ-Ⅳ期IDC中高于Ⅰ-Ⅱ期(P=0.023，P=0.000)；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌中高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P=0.028，P=0.002)；而與患者的年齡、腫瘤大小無明顯相關(guān)性(P=0.7881，P=0.773；P=0.739，P=0.895)。 2、p-p38、p-ezrin在乳腺細(xì)胞系中的表達(dá) (1)Western blot檢測，乳腺正常上皮細(xì)胞系10A和乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，435s中兩種

17、蛋白表達(dá)水平呈遞增趨勢。 (2)選取兩種蛋白均高表達(dá)的高侵襲高轉(zhuǎn)移435s細(xì)胞系，熒光定位顯示：p-p38在胞核中強(qiáng)表達(dá)，在胞漿中僅有少量的表達(dá)；p-ezrin在胞漿和胞膜上彌散表達(dá)，均顯示綠色熒光；F-actin在胞漿和胞膜上表達(dá)，呈紅色，雙色熒光分析顯示p-ezrin和F-actin在同一細(xì)胞內(nèi)共位表達(dá)。 3、p38MAPK信號通路特異性阻斷劑SB203580作用MDA-MB-435s細(xì)胞系24h后觀察各指標(biāo)改變