p38MAPK與整合素β3在乳腺癌中表達的相關性研究.pdf

1、目的： 癌細胞侵襲和轉移是一個復雜的過程，涉及到多方面的因素作用，細胞與細胞外基質(extracelullar matrix，ECM)的黏附是惡性腫瘤侵襲的首要步驟。腫瘤細胞與ECM的黏附是通過細胞表面的特異受體介導的，其中最重要的黏附分子為整合素家族。近來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞表面的整合素受體與ECM黏附所致的腫瘤細胞游離出或通過基底膜的過程，是惡性腫瘤浸潤生長和遠處轉移的始動步驟。生腱蛋白(Tenascin-c,TN-c)是EC

2、M中一種具有獨特六臂體結構的寡聚糖蛋白，也是整合素的重要配體之一。p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase，MAPK)家族的重要成員，最近，p38MAPK信號通路因以正性調節(jié)的方式參與腫瘤的侵襲轉移過程而倍受關注。為此，本研究檢測了p-p38，整合素β3及其配體在乳腺癌組織中的表達情況，并進一步在體外研究p38MAPK通路與整合素β3的關系，為乳腺癌治療提供相應的理論依據。

3、 材料與方法： 1、材料 80例乳腺癌組織蠟塊取自中國醫(yī)科大學第一臨床學院病理科，為2001年～2005年手術切除標本。依據WHO2003年所推薦的乳腺癌組織學分類標準進行分類，80例均為浸潤性導管癌。人乳腺癌細胞系MDA-MB-231及MCF-7購自協(xié)和醫(yī)科大學細胞庫。 2、主要試劑 鼠抗人p-p38單克隆抗體和兔抗人整合素β3多克隆抗體購自Cell signaling公司，鼠抗人TN-c單克隆抗體購

4、自Sigma公司，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(S-P)超敏免疫組化試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒均購自福州邁新公司。DMEM及RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司。 3、方法免疫組織化學步驟采用SP法。以PBS 代替一抗設立空白對照，以已知乳腺癌陽性片作為陽性對照。結果判定：每張切片在光鏡下隨機選取5個視野。整合素β3和p-p38的每個視野計數(shù)100個瘤細胞，根據陽性細胞占全部腫瘤細胞的百分比分為：陽性細胞數(shù)<50％為

5、陰性(-)；陽性細胞數(shù)>50％為陽性(+)。TN-c在細胞外基質中的陽性表達為基質呈斷線狀、連續(xù)線狀或網狀棕黃色著色。著色強度分為無色或淺黃色為陰性(-)，黃色或棕黃色為陽性(+)。 Western印跡法：RIPA buffer裂解液，超聲處理，高速低溫離心提取總蛋白，用Bradford法進行蛋白濃度測定。SDS-PAGE電泳，轉印，封閉后加相應一抗、二抗及DAB顯色，觀察拍照，進行灰度值測定。 4、統(tǒng)計學分析

6、行x<'2>檢驗和Pearson相關分析。確定P<0.05為差異有顯著性。 結果： 1、p-p38、整合素β3、TN-c在乳腺癌組織中的表達及相關性分析免疫組化結果顯示，p-p38蛋白主要位于乳腺癌細胞核內，呈棕黃色顆粒，陽性率為57.50％(46/80)。整合素β3蛋白主要位于乳腺癌細胞漿內，呈棕黃色顆粒，陽性率為56.25％(45/80)，而在正常乳腺中不表達；TN-c蛋白主要分布于細胞外基質中，呈斷線狀、連續(xù)線狀或

7、網狀著色，陽性率為86.25％(69/80)，在正常乳腺中，表達于基底膜。統(tǒng)計學分析顯示，每兩者之間表達分別存在正相關(r=0.584，P<0.05；r=0.237，P<0.05；r=0.293，P<0.05)。 2、乳腺癌組織中p-p38、整合素β3、TN-c表達與臨床病理特征的關系p-p38、整合素β3及TN-c表達與乳腺癌淋巴結轉移及臨床分期有關(P<0.05)，而與患者的年齡、腫瘤大小無明顯相關性(P>0.05)。

8、 3、兩種轉移性不同的乳腺癌細胞中p-p38、整合素β3、TN-c的表達Western印跡法檢測結果顯示，高轉移性的MDA-MB-231細胞中p-p38及整合素β3、TN-c表達水平高于低轉移性的MCF-7細胞。MCF-7細胞中TN-c不表達。 4、用anti-整合素β3和anti-TN-c抗體分別阻斷MDA-MB-231細胞后p-p38蛋白表達的變化用20μg/ml的抑制性anti-整合素β3抗體及抑制性anti-TN-c抗

9、體分別處理MDA-MB-231細胞24h后，用Western blot檢測MDA-MB-231細胞中p-p38的表達量。結果顯示，兩種方法處理后的乳腺癌細胞MDA-MB-231的p-p38蛋白表達水平均下降。 結論： 1、整合素β3、TN-c、p-p38表達與乳腺癌臨床分期及淋巴結轉移有關。 2、整合素β3、TN-c和p-p38在乳腺癌中表達存在正相關。 3、阻斷整合素β3、TN-c后，乳腺癌細胞中p-p