GSK3β在乳腺癌細胞系中的表達及其與P38MAPK相關性的研究.pdf

1、GSK3β是糖原合成激酶 3（glycogen synthesis kinase，GSK-3）的亞型之一。近年來越來越多的研究證實，GSK3β不僅僅參與糖原代謝過程，它更是一個多功能激酶，在蛋白合成、細胞增殖、細胞分化、細胞運動以及腫瘤發(fā)生等方面都扮演了重要角色。近來研究發(fā)現(xiàn)，GSK3β在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要作用，并參與了乳腺癌細胞生長和細胞凋亡信號通路調(diào)控。但是，GSK3β是否參與了乳腺癌細胞的轉移仍然是個有待于研究的問題

2、。p38MAPK 是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族的重要成員。最近，p38MAPK信號通路因以正性調(diào)節(jié)的方式參與腫瘤的侵襲轉移過程而倍受關注。為此，本研究檢測了 p-p38，p-GSK3βser9，GSK3β在乳腺癌細胞系中的表達情況，并進一步研究GSK3β在乳腺癌侵襲中的作用以及GSK3β和p38MAPK 通路的關系，為乳腺癌治療提供相應的理論依據(jù)。
　　

3、材料與方法：
　　 1、材料
　　 （1）細胞系 人乳腺癌細胞系MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-435s，原購自北京協(xié)和基礎醫(yī)學院細胞中心，本實驗由中國醫(yī)科大學已有的細胞復蘇而得。
　　 （2）主要試劑 鼠抗人p-p38抗體購自Cell signaling 公司。兔抗人 GSK3β抗體購自 Bioworld 公司。兔抗人 p-GSK3βser9抗體購自 Santa 公司。p38MAPK特異性抑制劑

4、SB203580購自美國Calbiochem公司。GSK3β特異性抑制劑SB216763購自Cayman公司。Transwell 小室（孔徑8um）購自 Corning 公司。
　　 2、方法
　　 （1）Western 印跡法 收集細胞加入RITA buffer 裂解液，超聲處理，高速低溫離心提取總蛋白，用Bradford法進行蛋白濃度測定。SDS-PAGE 電泳，轉印，封閉后加相應一抗、二抗。ECL發(fā)光，觀察拍照，進

5、行灰度值測定。
　　 （2）免疫熒光染色 取對數(shù)生長細胞接種到孔板中。固定、TritonX-100處理、封閉后加相應一抗、二抗，復染細胞核，熒光顯微鏡觀察拍照。
　　 （3）Transwell 實驗 Transwell小室接種細胞后培養(yǎng)，擦去上室內(nèi)細胞后固定，染色，觀察拍照，進行細胞計數(shù)。
　　 3、統(tǒng)計學分析
　　 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件行數(shù)據(jù)處理：采用t檢驗分析Western Blot圖像灰度值

6、、Transwell穿膜細胞數(shù)，用LSD-t檢驗對各樣本均數(shù)行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1、p-p38、p-GSK3βser9，GSK3β在乳腺癌細胞系中的表達
　　 （1）Western 印跡法檢測，在三種乳腺癌細胞系 MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-435s 中，p-GSK3βser9 和p-p38的表達呈遞增趨勢，GSK3β表達無明顯差別。
　　

7、 （2）選取p-p38，p-GSK3βser9均高表達的高侵襲高轉移細胞系MDA-MB-435s，免疫熒光定位顯示：p-p38在MDA-MB-435s中主要表達在細胞核，細胞漿中僅有微弱的表達；而p-GSK3βser9在 MDA-MB-435s 中主要表達在細胞漿，細胞核中僅有微弱的表達。
　　 2、GSK3β抑制劑LiCL和SB216763作用MDA-MB-435s細胞系24h后p-GSK3βser9和GSK3β變化
　

8、　 （1）Western 印跡法檢測顯示：LiCL和SB216763均可上調(diào)p-GSK3βser9表達水平，GSK3β無明顯變化。
　　 （2）免疫熒光定位顯示：SB216763 作用 MDA-MB-435s 細胞系24h后p-GSK3βser9胞漿表達減少，核表達增多。
　　 （3）Transwell 實驗顯示：SB216763 能濃度依賴性地增加乳腺癌細胞MDA-MB-435s的侵襲轉移潛能。
　　 3、P

9、38MAPK抑制劑SB203580對GSK3β活性的影響
　　 Western 印跡法檢測顯示，SB203580 濃度性依賴性的地下調(diào) MDA-MB-435s中 p-p38，p-GSK3βser9蛋白的表達，但不影響GSK3β蛋白的表達。
　　 討論：
　　 GSK3β是一個多功能的蛋白激酶，它在蛋白合成、細胞增殖、細胞分化和細胞運動等方面發(fā)揮重要作用。GSK3β的活性主要通過3種不同方式共同調(diào)節(jié)：（1）不同位點

10、的磷酸化狀態(tài)調(diào)節(jié) GSK3β活性。在N端絲氨酸9（Ser9）處磷酸化可降低GSK3β活性，而在酪氨酸 216（Tyr216）處磷酸化則可增強它的活性；（2）細胞內(nèi)定位調(diào)控GSK3β活性。GSK3β大部分存在于細胞質中，但轉位入核后 GSK3β對于細胞周期的調(diào)控、促進腫瘤發(fā)生的活性才得以發(fā)揮；（3）底物磷酸化水平的不同調(diào)控GSK3β活性。大部分GSK3β的底物都必須首先被其他激酶磷酸化（一次磷酸化），才能被GSK3β識別并受其磷酸化（二次

11、磷酸化）。因此底物的磷酸化水平改變底物的可識別性，從而調(diào)控GSK3β的活性。目前，有關GSK3β對腫瘤的作用究竟是抑癌還是促癌，尚無定論。
　　 p38MAPK 信號通路能通過磷酸化作用激活多種轉錄因子，參與調(diào)節(jié)細胞反應，包括c-Jun，c-fos，和ATF2?；罨膒38MAPK還可激活轉錄因子MEF2C、ELK-1、MAX和CHOP。另外，P38 通路還參與細胞骨架蛋白的合成，應用p38MAPK抑制劑SB203580可抑制細

12、胞的運動。
　　 本文通過觀察GSK3β的活性變化對乳腺癌細胞侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)，隨著乳腺癌細胞系MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-435s侵襲力的增加，p-GSK3βser9蛋白表達呈遞增趨勢；而總GSK3β表達無明顯差別，提示GSK3β活性與乳腺癌侵襲力負相關。Transwell 實驗結果顯示，隨著抑制劑 GSK3β抑制劑 SB216763的濃度增加，MDA-MB-435s 細胞的侵襲力是逐漸升高的。也就是說

13、GSK3β活性的降低可以增加乳腺癌細胞系 MDA-MB-435s的侵襲能力。我們又進一步進行了乳腺癌細胞系免疫熒光定位，結果顯示：p-GSK3βser9主要定位于細胞漿。而SB216763作用MDA-MB-435s 細胞系24h后 p-GSK3βser9核表達增多，漿表達減少。說明p-GSK3βser9可通過核內(nèi)外運動來改變GSK3β的活性，進而調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的侵襲能力。已證實，GSK3β在胞漿、胞核及線粒體內(nèi)都存在，與胞漿相比，胞核及

14、線粒體部位的GSK3β活性更高。胞核中的GSK3β調(diào)節(jié)了很多轉錄因子，其在胞核中水平不是恒定的，而是根據(jù)胞內(nèi)一些因素的改變而發(fā)生劇烈變化。所以我們推測胞核中的GSK3β可能在調(diào)節(jié)乳腺癌侵襲基因方面發(fā)揮更為主要的作用。
　　 許多研究發(fā)現(xiàn)了GSK3β和P38MAPK存在一定的聯(lián)系，那么兩者在乳腺癌中的關系如何呢?我們采用不同濃度P38MAPK特異性抑制劑SB203580作用于MDA-MB-435s細胞系，實驗結果顯示：SB2035

15、80可以濃度依賴性地下調(diào)乳腺癌高轉移細胞系MDA-MB-435s中pGSK3βser9蛋白表達水平。也就是說抑制P38MAPK通路可能直接或間接下調(diào)pGSK3βser9表達水平，從而增加GSK3β活性，進而在乳腺癌的侵襲中發(fā)揮一定的作用，但其確切機制有待于進一步研究。
　　 我們的結果顯示，抑制GSK3β活性可以促進乳腺癌細胞系的侵襲能力，并且在乳腺癌細胞系中GSK3β3和P38MAPK之間呈負相關。目前，GSK3β和p38MA