卵巢癌細胞系中miRNA表達差異的比較與miR-199a預測靶基因GSK3β的相關性研究.pdf

1、目的：
　　 卵巢癌是一類高致死率的婦科腫瘤,90％發(fā)生于卵巢表面的上皮組織,其余發(fā)生于卵巢的間質(zhì)細胞和生殖細胞。卵巢表面上皮細胞的特征與正常的上皮組織不同,它具有間質(zhì)細胞特征。卵巢上皮組織雖然與輸卵管和子宮內(nèi)膜上皮組織胚胎來源相同,但是這兩種組織具有正常上皮組織特征能夠表達E-cadherin(上皮鈣粘素)和其他keratin蛋白。卵巢上皮細胞轉(zhuǎn)變成腫瘤細胞以后才會表現(xiàn)正常上皮特征,如E-cadherin的表達,而其他上皮組織

2、腫瘤在腫瘤發(fā)展過程中丟失E-cadherin表達。卵巢腫瘤的組織性分類取決于其在發(fā)展過程中所獲得的組織特征,如漿液性(輸卵管),子宮內(nèi)膜性(子宮內(nèi)膜),粘液性(宮頸管內(nèi)膜)與透明細胞性(中腎上皮組織)。近年來,人們開始從分子生物學的角度著手研究卵巢腫瘤的發(fā)生發(fā)展,卵巢腫瘤的組織特性和其致癌基因的突變,這兩方面的信息促使對卵巢腫瘤新的分類。根據(jù)卵巢腫瘤的發(fā)展特征的不同,卵巢腫瘤可分為一型和二型。一型卵巢腫瘤發(fā)展慢,包括良性、邊界性和惡性三

3、個階段和這種癌癥包括低等漿液卵巢癌、粘液卵巢癌、子宮內(nèi)膜卵巢癌、惡性Brenner腫瘤和透明細胞卵巢腫瘤。其中漿液癌有BRAF和KRAS基因突變,粘液癌有β-catenin和PTEN突變,子宮內(nèi)膜癌存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定等。二型卵巢腫瘤發(fā)展快,很少見前體腫瘤,惡性程度高,治療難度大,包括惡性漿液卵巢癌、惡性混和中胚層性腫瘤(mixed mesodermal tumor)和未分化卵巢癌,一般有p53基因突變。
　　 MicroRNA是一

4、類非編碼RNA,它們基于與靶mRNA的序列互補抑制翻譯起始,或者導致靶mRNA降解,在細胞中發(fā)揮重要作用。到目前為止,人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾百個miRNA,它們的表達取決于細胞的組織類型。研究已經(jīng)表明miRNA可能作為潛在的癌基因或抑癌基因。在卵巢腫瘤中,一些miRNA表達升高和一些miRNA低表達,其中miR-200家族高表達,miR-125/miR-100/let-7家族低表達。除了這兩個家族以外,miR-199家族、miR-21、miR

5、-221等miRNA也存在表達差異。腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲能力與細胞的上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(Epithelialmesenchymal transition,EMT)這一生物化學過程密切相關。最近的研究表明,一些特殊miRNA的表達變化能夠促進這一過程,如miR-125a及miR-200家族的低表達能促進卵巢腫瘤細胞的上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化,從而提高細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。研究表明,miR-214的表達升高與卵巢癌的cisplatin耐藥性有

6、直接關系,miR-199a能夠抑制某些具有促進EMT過程的基因的表達。
　　 本研究以三種卵巢癌上皮細胞系為研究對象,探討已經(jīng)證明的miR-125a、miR-200a、miR-214a和miR-199a的表達差異,并探討miR-199a與其預測靶基因糖原合酶激酶3β(GSK3β)的可能的關系。
　　 方法：
　　 1、細胞培養(yǎng),將卵巢上皮癌細胞系A2780、CAOV3和OVCAR3接種到含10％小牛血清、100U

7、/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,在飽和濕度37℃、5％CO2的孵箱中傳代培養(yǎng)。
　　 2、應用RT-PCR的方法檢測E-cadherin、Twist1、DDR1(Discoidm DomainReceptor1)、GSK3β等基因mRNA在三種卵巢癌細胞系中的表達差異。
　　 3、應用實時PCR的方法檢測miR-125a、miR-199a、miR-200a和miR-214在三種卵巢癌細胞系中的表達

8、差異。
　　 4、應用Western Blot方法檢測蛋白濃度。TargetScan、PicTar、Microcosm等預測miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫顯示miR-199a能抑制GSK3β。所以我們應用Westernblot的方法檢測GSK3β在卵巢癌細胞系A2780和OVCAR3中的表達差異。
　　 結果：
　　 1、RT-PCR結果顯示,E-cadherin在轉(zhuǎn)移細胞系A2780中沒有表達,在上皮特征卵巢癌細胞系O

9、VCAR3中有表達。Twist1 mRNA在OVCAR3和A2780中均有表達,但在CAOV3沒有表達。
　　 2、實時PCR結果顯示,miR-125a、miR-199a和miR-200a在轉(zhuǎn)移細胞系A2780中低表達,而在具有上皮細胞特征的卵巢癌細胞系OVCAR3中高表達;miR-214在cisplatin強耐藥性細胞系OVCAR3中的表達高于其在弱耐藥性細胞系CAOV3中的表達。
　　 3、RT-PCR結果顯示,在不

10、同卵巢癌細胞系中,已經(jīng)證明的miR-199a的靶基因DDR1表達有差異,在A2780細胞中表達最多,OVCAR中表達最少。miR-199a預測靶基因GSK38在mRNA水平上表達沒有明顯差異。
　　 4、Western Blot結果顯示,在不同卵巢癌細胞系中,miR-199a預測靶基因GSK3B在蛋白表達水平上有明顯差異。
　　 結論：
　　 1、本研究表明與卵巢癌細胞轉(zhuǎn)移能力有關的miRNA,如miR-125a