整合素αvβ3對乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移的作用.pdf

1、整合素是由α(120～185kD)和β(90～110kD)兩個亞單位形成的異二聚體。整合素具有兩種主要功能，一為傳遞細胞內(nèi)外之信息，另一為細胞與胞外基質(zhì)間的連接橋梁。乳腺癌轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者的主要致死原因。近年來對乳腺癌轉(zhuǎn)移機制研究顯示：由整合素介導的細胞間及與細胞外基質(zhì)的相互作用等信號事件在乳腺腫瘤形成、生長、侵襲、轉(zhuǎn)移諸多過程中起了重要作用。 本實驗研究乳腺癌細胞株中整合素αvβ3受體的表達及其對腫瘤細胞粘附、遷移能力的影響，

2、探討整合素αvβ3對腫瘤細胞跨膜信號的調(diào)節(jié)作用，以及采用抗整合素αvβ3抗體對裸鼠乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移模型的治療實驗，最后檢測整合素αvβ3表達與乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移關系，尋求臨床應用抗整合素αvβ3抗體治療乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移的可行性。 第一部分整合素αvβ3在乳腺癌細胞株的表達及對細胞粘附、遷移的影響 [目的]檢測乳腺癌細胞株MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s整合素αvβ3的表達狀況，通過細胞粘附、遷移實驗了

3、解整合素αvβ3對乳腺癌細胞的作用。 [材料和方法]細胞培養(yǎng)：MCF-7細胞采用含10﹪小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，MDA-MB-231細胞采用含10﹪胎牛血清的1640培養(yǎng)，MDA-MB-435s細胞采用含10﹪胎牛血清的L15培養(yǎng)基培養(yǎng)，實驗取上述對數(shù)生長期細胞。 流式細胞儀檢測人乳腺癌細胞株MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s整合素αvβ3的表達。 細胞粘附實驗：采用玻璃體結合蛋白細胞粘附試

4、劑盒。玻璃體結合蛋白濃度梯度為(0.01～20μg/ml)，上述細胞按3.5×105/ml，每孔0.1ml細胞懸液置于96孔板中，37℃，5﹪CO2孵箱孵育2小時，染色后，全自動定量酶標儀550nm讀數(shù)。 細胞遷移試驗：采用玻璃體結合蛋白定量細胞遷移試驗試劑盒。各取2.5×105MDA-MB-231、MDA-MB-435s細胞，抗整合素αvβ3抗體LM60925μg/ml封閉，對照組PBS替代抗體。置細胞于孔徑8μm的Boyde

5、n小室中，37℃，5﹪CO2孵箱孵育24小時，染色后，全自動定量酶標儀檢測。 [結果]人乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s整合素αvβ3的表達情況顯示：整合素αvβ3抗體LM609與上述細胞株結合，熒光表達陽性的細胞比率分別為：0.73﹪、85.88﹪、96.42﹪。按熒光檢測陽性細胞數(shù)＞5﹪為整合素αvβ3受體陽性，表明MCF-7細胞膜上整合素αvβ3受體為陰性，MDA-MB-231、MDA-

6、MB-435s細胞膜上整合素αvβ3受體陽性。 細胞粘附實驗顯示：MDA-MB-231、MDA-MB-435s細胞粘附能力在玻璃體結合蛋白濃度為0.05～1μg/ml時，隨濃度梯度增強。MCF-7細胞則無明顯變化。 遷移實驗結果顯示；整合素αvβ3受體陽性細胞具有對細胞外基質(zhì)蛋白--玻璃體結合蛋白的趨觸性，這種特性使其能穿過微孔遷移。經(jīng)抗體處理后，細胞遷移能力減弱(MDA-MB-231t=12.3p＜0.01、MDA-M

7、B-435st=22.5p＜0.01、MCF-7t=0.45p＞0.05)。 [結論]整合素αvβ3在惡性程度較高的乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435s中呈高表達。而在MCF-7細胞株中低表達。細胞膜上整合素αvβ3受體陽性的細胞具有較強的粘附性和遷移能力，此類腫瘤細胞更具侵襲、轉(zhuǎn)移能力。這種能力會隨著受體的封閉而減弱。 第二部分整合素αvβ3對腫瘤細胞跨膜信號的調(diào)節(jié) [目的]檢測細胞內(nèi)鈣離子

8、、粘著斑激酶磷酸化水平的變化，以及腫瘤細胞凋亡狀況，了解整合素αvβ3對腫瘤細胞跨膜信號的調(diào)節(jié)作用。 [材料和方法]細胞漿內(nèi)鈣離子檢測：MDA-MB-231、MDA-MB-435s接種于涂有玻璃體結合蛋白的24孔板中，對照組為牛血清白蛋白。加含Ca2+PBS，加鈣離子熒光探針fluo-3AM，共聚焦顯微鏡觀察。結果按256級灰度值計算。 Westernblot方法檢測粘著斑激酶磷酸化水平。MDA-MB-231、MDA-M

9、B-435s細胞株經(jīng)玻璃體結合蛋白(1μg/ml)處理，對照組PBS。細胞內(nèi)粘著斑激酶發(fā)生酪氨酸磷酸化的情況。 腫瘤細胞凋亡的檢測：用抗整合素αvβ3抗體LM609(25μg/ml)封閉人乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-435s細胞株后，對照組PBS替代抗體，流式細胞儀檢測腫瘤細胞凋亡的狀況。 [結果]共聚焦顯微鏡觀察MDA-MB-231細胞株中，細胞漿內(nèi)鈣離子濃度玻璃體結合蛋白組(灰度值106)較BSA對照組

10、(灰度值43)增高146.5﹪，而在MDA-MB-435s細胞株中鈣離子濃度玻璃體結合蛋白組(灰度值111)較BSA對照組(灰度值57)增高94.7﹪。顯示整合素αvβ3受體陽性的細胞與其配體結合后，可促使細胞漿內(nèi)鈣離子濃度顯著增高。 Westernblot方法檢測結果顯示：MDA-MB-231細胞株細胞內(nèi)粘著斑激酶發(fā)生酪氨酸磷酸化表達較對照組增加98.2﹪，MDA-MB-435s細胞株的表達較對照組增加84.5﹪。 經(jīng)

11、流式細胞檢測細胞周期可以看出：MDA-MB-231細胞株實驗組腫瘤細胞凋亡率為8.47﹪，對照組為0.38﹪。MDA-MB-435s細胞株實驗組腫瘤細胞凋亡率為6.25﹪，對照組為1.14﹪。 [結論]經(jīng)玻璃體結合蛋白作用后，通過激活磷脂酶C，磷脂酶C分解磷酯酰肌醇二磷酸產(chǎn)生肌醇三磷酸刺激細胞內(nèi)鈣庫釋放，以及由離子通道介導細胞外鈣離子內(nèi)流，使細胞漿內(nèi)鈣離子濃度增高。自由鈣離子濃度可調(diào)節(jié)多種酶活性，并能作為第二或第三信使激活激酶鏈

12、(促分裂原活化蛋白激酶/c-Jun氨基端激酶)傳入細胞核，調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的表達。 整合素αvβ3與其配體玻璃體結合蛋白作用后，可以增強粘著斑激酶發(fā)生酪氨酸磷酸化，粘著斑激酶作為細胞運動的調(diào)節(jié)因子，與腫瘤細胞的運動和侵襲有關。其磷酸化后，能加強細胞運動性，增加細胞侵襲力。 缺乏特定的激素或生長因子將會導致細胞凋亡，而細胞外基質(zhì)也象這些激素和生長因子一樣是細胞存活因子。腫瘤細胞--基質(zhì)間接觸被壞會引起細胞凋亡，這

13、種現(xiàn)象稱作失巢凋亡。隨著整合素αvβ3受體的封閉增加腫瘤細胞凋亡。 第三部分整合素αvβ3在乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移中作用的動物實驗 [目的]研究抗整合素αvβ3抗體LM609對裸鼠乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移模型的治療作用。 [材料和方法]3周齡BALB/c雌性裸鼠，體重17～21g。MDA-MB-231、MDA-MB-435s細胞株。實驗組用LM609，25μg/ml封閉受體，對照組PBS替代抗體。單細胞懸液左心室內(nèi)注射。一周后

14、，實驗組從尾靜脈按2mg/kg注射LM609。對照組為PBS。2周后處死，收集骨髓。提取總RNA，KT19為模板，實時熒光定量RT-PCR檢測。 [結果]用標準對照組作相對定量標準曲線，相對起始量為橫坐標，循環(huán)閾值(cyclethreshold,Ct)為縱坐標相對定量標準曲線。其斜率為-3.365,相關系數(shù)為0.967，擴增效率98.2﹪。內(nèi)參β-actin所測得實驗與對照組Ct值的差值為△Ct。各實驗組KT19所測得Ct值與△

15、Ct值的差值為△△Ct。將循環(huán)閾值處擴增量定為1，則實驗組相對起始量=(1+AE)-△△Ct，對照組相對起始量=(1+AE)-Ct，AE為擴增效率。將相對起始量進行t檢驗。結果為，MDA-MB-231細胞組t=15.87(P＜0.05)。MDA-MB-435s細胞組t=19.29(P＜0.05)，實驗組與對照組有顯著差異。由整合素αvβ3受體陽性細胞制作的裸鼠乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移模型中，經(jīng)LM609處理后，可顯著減少乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移的細胞。

16、 [結論]本研究動物實驗結果顯示，應用Lm609對乳腺癌細胞株受體封閉，可抑制裸鼠模型中整合素αvβ3受體陽性的乳腺癌細胞骨髓微轉(zhuǎn)移。因而提示，可采用抗整合素αvβ3抗體來抑制乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移。 第四部分乳腺癌中整合素αvβ3表達與乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移的相關性及其意義[目的]檢測乳腺癌標本整合素αvβ3表達及乳腺癌患者骨髓微移狀況，研究其相關關系。 [材料和方法]69例女性乳腺癌患者，術中采集骨髓。RT-PCR，KT

17、19檢測骨髓微轉(zhuǎn)移。腫瘤組織整合素αvβ3受體的檢測采用SABC免疫組織化學方法，10例乳腺纖維瘤患者標本作對照。 [結果]乳腺癌標本免疫組化結果，以細胞膜著色呈棕黃色為整合素αvβ3陽性細胞，陽性細胞＞10﹪為結果陽性。整合素αvβ3陽性患者30例，占43.5﹪；陰性患者39例，占56.5﹪。乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移RT-PCR檢測陽性患者22例，占31.9﹪；陰性患者占68.1﹪?？ǚ綑z驗，X2=9.564，P＜0.05。兩者有顯著