整合素αvβ6在結(jié)腸癌與甲狀腺癌中的作用研究.pdf

1、第一部分:整合素αvβ6在結(jié)腸癌細(xì)胞化療耐藥中的作用研究
　　研究背景
　　結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率居第三位，致死率居第四位的惡性消化道腫瘤。近年來(lái)隨著環(huán)境污染日益嚴(yán)重和人們飲食結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率逐步上升。目前，手術(shù)切除仍然是治療結(jié)直腸癌的主要方式。然而，在可切除的結(jié)直腸癌患者中，大約50％患者將會(huì)復(fù)發(fā)，其中絕大部分患者失去再治愈的機(jī)會(huì)。目前研究認(rèn)為，Ⅲ期結(jié)直腸癌病人術(shù)后需全身輔助化療以消滅體內(nèi)的微小轉(zhuǎn)移

2、病變，減少腫瘤復(fù)發(fā)及改善生存。以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)為基礎(chǔ)的多種化療方案應(yīng)用于臨床已達(dá)30余年，但因原發(fā)性或獲得性耐藥的產(chǎn)生，化療往往達(dá)不到滿(mǎn)意效果甚至歸于失敗。雖然近年不斷涌現(xiàn)一批新穎的化療藥物，如伊立替康、奧沙利鉑等，耐藥性的產(chǎn)生仍是目前結(jié)直腸癌化療領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。
　　整合素是細(xì)胞表面粘附分子的一種，由α和β兩種亞基結(jié)合而成，目前已發(fā)現(xiàn)由18種α亞基和8種β亞基組成的24種整合素成員。一

3、方面，整合素在胞外連接基質(zhì)蛋白或相鄰細(xì)胞，在胞內(nèi)連接細(xì)胞骨架系統(tǒng)，從而構(gòu)成腫瘤細(xì)胞賴(lài)以生存發(fā)展的空間紐帶;另一方面，整合素作為受體可與多種細(xì)胞因子結(jié)合，從而向細(xì)胞內(nèi)外雙向傳導(dǎo)生物信息，構(gòu)成腫瘤細(xì)胞感受外界刺激并作出相應(yīng)反應(yīng)的的信息樞紐。研究發(fā)現(xiàn)，整合素參與了腫瘤化療耐藥過(guò)程。在腫瘤耐藥株已發(fā)現(xiàn)多種整合素亞型表達(dá)上調(diào)。另外，整合素可能參與了化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程。應(yīng)用各種分子生物學(xué)技術(shù)，如抗體阻斷，siRNA干擾等，阻斷整合素與胞

4、外基質(zhì)及細(xì)胞之間的連接，可有效抑制腫瘤細(xì)胞的化療耐藥性。整合素成為解決腫瘤化療耐藥的極有潛力的靶向目標(biāo)。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用微陣列技術(shù)分析腫瘤的整合素表型，可以選擇最有效的化療藥物或化療方案，而針對(duì)這些表型進(jìn)行個(gè)體化治療，將具有良好的臨床應(yīng)用前景。
　　整合素αvβ6僅在上皮組織表達(dá)，在胚胎形成、組織修復(fù)過(guò)程及某些癌組織表達(dá)增強(qiáng)，而在正常組織和良性腫瘤組織幾無(wú)表達(dá)。我們前期研究發(fā)現(xiàn):αvβ6在結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移、胞外基質(zhì)降解等腫瘤惡性生物

5、學(xué)行為發(fā)揮重要作用。另外，αvβ6與ERK2之間存在著生理性直接連接，該直接連接對(duì)αvβ6在結(jié)腸癌發(fā)揮調(diào)控功能起著關(guān)鍵作用。然而，αvβ6是否在結(jié)直腸癌化療耐藥過(guò)程發(fā)揮作用迄今尚不明確。在上述背景下，本研究擬選擇兩種結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480和HT-29及結(jié)直腸癌化療代表性藥物-5-FU，在細(xì)胞水平深入研究αvβ6是否在結(jié)腸癌化療耐藥過(guò)程發(fā)揮作用并探索其作用機(jī)制。
　　第一節(jié)整合素αvβ6對(duì)5-FU作用下結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

6、r>　　目的
　　研究整合素αvβ6對(duì)5-FU誘導(dǎo)的SW480和HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制及凋亡的影響。
　　方法
　　1.SW480結(jié)腸癌細(xì)胞分為野生組（SW480wild-type）、已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染含β6基因質(zhì)粒組(SW480β6-transfectant)和轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組(SW480Mock-transfectant)，分別用流式細(xì)胞術(shù)、westernblotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組細(xì)胞αvβ6蛋白的表達(dá)情況。

7、　　2.利用pSIREN-DNR-DsRed-ExpressVector質(zhì)粒構(gòu)建β6特異性shRNA表達(dá)載體及對(duì)照組載體，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞，分別用流式細(xì)胞術(shù)、westernblotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HT-29wild-type、β6-shRNA、control-shRNA三組細(xì)胞αvβ6蛋白的表達(dá)情況。
　　3.以不同濃度5-FU(0.2、1、5、25、125μg/mL)作用于SW480和HT-29各組細(xì)胞48h

8、，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制情況，并計(jì)算比較IC50。
　　4.以48hIC50濃度的5-FU作用于SW480和HT-29各組細(xì)胞48h，Hoechst33258凋亡形態(tài)法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果
　　1.流式細(xì)胞術(shù)及westernblotting實(shí)驗(yàn)均表明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染含β6基因質(zhì)粒的SW480細(xì)胞(SW480β6-transfectant)顯著表達(dá)整合素β6，而野生型細(xì)胞或轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒細(xì)胞不表達(dá)整合素β6

9、，三組細(xì)胞整合素αv的表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)及westernblotting實(shí)驗(yàn)均表明，與control-shRNA比較，β6-shRNA可顯著降低HT-29細(xì)胞整合素β6的表達(dá)，但對(duì)整合素αv的表達(dá)無(wú)明顯影響。
　　3.MTT實(shí)驗(yàn)表明，在不同濃度5-FU作用下，SW480β6-transfectant組細(xì)胞存活率均高于SW480wild-type及Mock-transfectant組;在HT-29細(xì)胞，β6-

10、shRNA可顯著降低5-FU作用下的細(xì)胞存活率。
　　4.Hoechst33258凋亡形態(tài)法和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)均標(biāo)明，在不同濃度5-FU作用下，SW480β6-transfectant組細(xì)胞凋亡率均低于SW480wild-type及Mock-transfectant組;在HT-29細(xì)胞，β6-shRNA可顯著提高5-FU作用下的細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)論及意義
　　本節(jié)研究揭示，在結(jié)腸癌SW480和HT-29細(xì)胞，整合素αv

11、β6均可保護(hù)細(xì)胞抑制5-FU誘導(dǎo)的增殖抑制及凋亡從而增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的化療耐藥能力，豐富了整合素αvβ6的理論知識(shí)，并為結(jié)腸癌的靶向治療或輔助化療研究提供了確切的理論依據(jù)。
　　第二節(jié)整合素αvβ6對(duì)5-FU誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞線粒體凋亡途徑的影響
　　目的
　　研究整合素αvβ6對(duì)5-FU誘導(dǎo)的SW480和HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞線粒體凋亡途徑的影響。
　　方法
　　1.細(xì)胞分組同第一節(jié)。
　　2.以48hI

12、C50濃度的5-FU作用于SW480和HT-29各組細(xì)胞48h，westernblotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胞漿cytochromeC表達(dá)情況。
　　3.以48hIC50濃度的5-FU作用于SW480和HT-29各組細(xì)胞48h，活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)caspase-3和caspase-9活性情況。
　　4.以48hIC50濃度的5-FU作用于SW480和HT-29各組細(xì)胞48h，westernblotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Bcl-2和Bax

13、蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果
　　1.westernblotting實(shí)驗(yàn)表明，在5-FU作用下，SW480三組細(xì)胞的胞漿cytochromeC表達(dá)均有增強(qiáng)，但β6-transfectant組細(xì)胞胞漿cytochromeC增強(qiáng)程度顯著低于SW480wild-type及Mock-transfectant組;在HT-29細(xì)胞，與wild-type或control-shRNA組比較，β6-shRNA使5-FU介導(dǎo)的胞漿cytochrom

14、eC的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)。
　　2.活性檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)表明，在5-FU作用下，SW480三組細(xì)胞的caspase-3和caspase-9活性均有增強(qiáng)，但β6-transfectant組細(xì)胞增強(qiáng)程度顯著低于SW480wild-type及Mock-transfectant組;在HT-29細(xì)胞，與wild-type或control-shRNA組比較，β6-shRNA使5-FU介導(dǎo)的caspase-3和caspase-9活性增強(qiáng)進(jìn)一步加劇。<

15、br>　　3.westernblotting實(shí)驗(yàn)表明，在5-FU作用前后，SW480β6-transfectant組細(xì)胞Bcl-2表達(dá)明顯高于wild-type及Mock-transfectant組，而B(niǎo)ax表達(dá)低于后二組;在HT-29細(xì)胞，與wild-type或control-shRNA組比較，β6-shRNA可顯著抑制Bcl-2表達(dá)而增強(qiáng)Bax表達(dá)，這種現(xiàn)象在5-FU作用前后均可發(fā)現(xiàn)。
　　結(jié)論及意義
　　本節(jié)實(shí)驗(yàn)揭示，

16、在結(jié)腸癌SW480和HT-29細(xì)胞，整合素αvβ6均可有效抑制5-FU誘導(dǎo)的線粒體凋亡途徑，包括抑制胞漿cytochromeC水平升高，抑制caspase-3和caspase-9活性增強(qiáng)，上調(diào)凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2表達(dá)而下調(diào)Bax表達(dá)等。本節(jié)研究明確了整合素αvβ6抑制5-FU誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，豐富了整合素αvβ6的理論知識(shí)，并為結(jié)腸癌的靶向治療或輔助化療研究提供了確切的理論依據(jù)。
　　第三節(jié)整合素αvβ6介導(dǎo)結(jié)腸癌

17、化療耐藥的細(xì)胞信號(hào)通路研究
　　目的
　　研究整合素αvβ6增強(qiáng)SW480和HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞化療耐藥能力的相關(guān)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路。
　　方法
　　1.細(xì)胞分組同第一節(jié)，westernblotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵因子磷酸化/總ERK(p/t-ERK)、磷酸化/總JNK(p/t-JNK)和磷酸化/總p-p38(p/t-p38)的表達(dá)情況。
　　2.細(xì)胞分組同第一節(jié)，以PD98059

18、阻斷ERK/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路，以48hIC50濃度的5-FU作用于SW480和HT-29各組細(xì)胞48h，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖，AnnexinV/PI-流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　3.SW480結(jié)腸癌細(xì)胞分為已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染含β6基因質(zhì)粒組（SW480β6-transfectant）、轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組(SW480Mock-transfectant)和轉(zhuǎn)染含β6突變基因質(zhì)粒組（轉(zhuǎn)染表達(dá)的β6蛋白缺失與ERK2的結(jié)合位點(diǎn)）(SW480β

19、6Mutant-transfectant);以48hIC50濃度的5-FU作用于SW480各組細(xì)胞48h，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖，AnnexinV/PI-流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，westernblotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡相關(guān)分子Bcl-2和Bax表達(dá)情況。
　　結(jié)果
　　1.westernblotting實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染表達(dá)β6可明顯增強(qiáng)SW480細(xì)胞p-ERK的表達(dá)，而β6-shRNA可明顯抑制HT-29細(xì)胞p-ERK的表達(dá)

20、;β6表達(dá)對(duì)t-ERK、p/t-JNK、p/t-p38的表達(dá)無(wú)顯著影響。
　　2.MTT增殖抑制實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)明，以PD98059阻斷ERK/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路，可有效抑制整合素αvβ6介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU的化療耐藥。
　　3.整合素β6缺失與ERK2的結(jié)合位點(diǎn)，可顯著抑制整合素αvβ6介導(dǎo)的p-ERK、Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)及Bax表達(dá)降低，有效抑制整合素αvβ6介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU的化療耐藥。
　　結(jié)

21、論及意義
　　本節(jié)實(shí)驗(yàn)揭示，整合素αvβ6通過(guò)ERK/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)結(jié)腸癌SW480和HT-29細(xì)胞對(duì)5-FU的化療耐藥，并在很大程度上依賴(lài)于β6與ERK2的直接結(jié)合。本節(jié)研究明確了整合素αvβ6介導(dǎo)結(jié)腸癌化療耐藥的具體信號(hào)傳導(dǎo)通路，豐富了整合素αvβ6的理論知識(shí)，并為結(jié)腸癌的靶向治療或輔助化療研究提供了確切的理論依據(jù)。
　　第二部分:整合素αvβ6在甲狀腺組織的表達(dá)及與甲狀腺癌臨床病理特征的關(guān)系
　　研究背

22、景
　　甲狀腺癌發(fā)病率在人類(lèi)全部癌癥不超過(guò)2％，但幾十年來(lái)其發(fā)病率一直在上升。目前，大多數(shù)甲狀腺癌為低度惡性，可用手術(shù)治愈的并對(duì)放射性碘具有良好的反應(yīng)性。然而甲狀腺癌的診斷治療仍然存在一些問(wèn)題。首先，細(xì)針抽吸活檢（fineneedleaspiration，F(xiàn)NA）是目前甲狀腺癌最準(zhǔn)確的診斷方法，但多達(dá)30％的病例仍然存在診斷困難。原因是許多乳頭和濾泡狀甲狀腺癌在結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于正常甲狀腺濾泡組織而使人無(wú)法做出確切判斷。出于避免遺漏惡性

23、腫瘤的目的，在很多診斷困難情況下往往施行大范圍的手術(shù)切除，而術(shù)后才發(fā)現(xiàn)為良性腫瘤。其次，一些甲狀腺癌具有侵襲轉(zhuǎn)移傾向，包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而這一點(diǎn)可能影響患者治療和預(yù)后。例如，占甲狀腺癌絕大多數(shù)的乳頭狀癌具有特征性的早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移傾向。有研究表明，甲狀腺癌患者年齡45歲以上且合并縱隔或頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，其死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。在上述情況下，需要尋找一種合適的分子標(biāo)志物，以增加診斷的準(zhǔn)確性和預(yù)測(cè)甲狀腺癌轉(zhuǎn)移潛能。
　　整合素是細(xì)胞

24、表面粘附分子的一種，由α和β兩種亞基結(jié)合而成，目前已發(fā)現(xiàn)由18種α亞基和8種β亞基組成的24種整合素成員。一方面，整合素在胞外連接基質(zhì)蛋白或相鄰細(xì)胞，在胞內(nèi)連接細(xì)胞骨架系統(tǒng)，從而構(gòu)成腫瘤細(xì)胞賴(lài)以生存發(fā)展的空間紐帶;另一方面，整合素作為受體可與多種細(xì)胞因子結(jié)合，從而向細(xì)胞內(nèi)外雙向傳導(dǎo)生物信息，構(gòu)成腫瘤細(xì)胞感受外界刺激并作出相應(yīng)反應(yīng)的的信息樞紐。
　　αvβ6屬于整合素的一種亞型，僅在上皮組織表達(dá)，在胚胎形成、組織修復(fù)過(guò)程及某些癌組織

25、表達(dá)增強(qiáng)，而在正常組織和良性腫瘤組織幾無(wú)表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，αvβ6參與了多種惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、增殖凋亡、腫瘤免疫、EMT等生物學(xué)功能。值得注意的是，整合素αvβ6表達(dá)與多種腫瘤的臨床病理特征及病人預(yù)后密切相關(guān)。在結(jié)腸癌，高表達(dá)αvβ6的結(jié)腸癌患者，與不表達(dá)或低表達(dá)者相比，其中位生存期明顯縮短;對(duì)早期結(jié)腸癌患者，高表達(dá)β6的患者其5年和10年生存率明顯降低。在胃癌，αvβ6的表達(dá)與Lauren分型、細(xì)胞分化、N分期及TNM分期密切相關(guān)。重要

26、的是，αvβ6陽(yáng)性患者其生存期明顯短于αvβ6陰性者。另外，在口腔鱗癌，乳腺癌及卵巢癌等，αvβ6表達(dá)與腫瘤的臨床病理特征及病人預(yù)后的關(guān)系也得到研究證實(shí)。
　　然而，αvβ6在甲狀腺癌的表達(dá)情況迄今未明。本研究利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了一系列惡性和非惡性的甲狀腺組織中αvβ6的表達(dá)。此外，我們利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法研究了αvβ6表達(dá)與甲狀腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　目的
　　檢測(cè)整合素αvβ6在各種甲狀腺組織中的表達(dá)

27、，研究整合素αvβ6與甲狀腺癌臨床病理特征的關(guān)系。
　　方法
　　1.購(gòu)買(mǎi)含有多種甲狀腺組織的微陣列芯片，從齊魯醫(yī)院病理科收集甲狀腺癌組織標(biāo)本及病人臨床病理信息。在研究之前，所有病例均邀請(qǐng)病理科專(zhuān)家進(jìn)行確診。
　　2.免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)標(biāo)本中αvβ6表達(dá)情況，并按確定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。
　　3.比較不同甲狀腺組織的αvβ6表達(dá)差異;研究αvβ6表達(dá)與甲狀腺癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性，包括年齡、性別、病理類(lèi)型、

28、TNM分期等。
　　結(jié)果
　　1.整合素αvβ6在不同甲狀腺組織的表達(dá)存在顯著差異。在正常甲狀腺組織，癌旁組織，甲狀腺腺瘤，整合素αvβ6表達(dá)一般為陰性或弱陽(yáng)性。其中，10例(10/10)正常甲狀腺組織均未檢測(cè)出αvβ6表達(dá)，只有1例(1/10)癌旁組織和3例(3/10)甲狀腺腺瘤組織αvβ6表達(dá)陽(yáng)性。整合素αvβ6在甲狀腺腫組織和甲狀腺炎組織多有廣泛而較強(qiáng)表達(dá)，其中7例(7/10)甲狀腺腫組織及8例(8/10)甲狀腺炎組織

29、αvβ6表達(dá)陽(yáng)性。在甲狀腺癌，有71例(71/90)αvβ6表達(dá)陽(yáng)性。此外，10例(10/10)甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶均檢測(cè)有αvβ6的表達(dá)。
　　2.αvβ6表達(dá)區(qū)別甲狀腺癌和非惡性甲狀腺組織的靈敏度為78.89％，特異度為62％，預(yù)測(cè)陽(yáng)性值為78.89％，而預(yù)測(cè)值陰性率為62％。檢測(cè)αvβ6表達(dá)可成功區(qū)別甲狀腺癌與正常甲狀腺組織、癌旁正常組織和甲狀腺腺瘤，但不能區(qū)別甲狀腺癌與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和甲狀腺炎組織。此外，乳頭狀甲狀腺

30、癌和濾泡狀甲狀腺癌之間的αvβ6表達(dá)無(wú)顯著差異。
　　3.αvβ6表達(dá)與甲狀腺癌患者的性別、腫瘤組織學(xué)形態(tài)、T分期和TNM分期之間無(wú)相關(guān)性，但和患者的年齡和N分期有相關(guān)性。
　　結(jié)論及意義
　　本研究表明整合素αvβ6在不同甲狀腺組織的表達(dá)存在顯著差異，檢測(cè)αvβ6表達(dá)以區(qū)別非惡性甲狀腺組織和甲狀腺癌具有良好的靈敏度和特異性。此外，整合素αvβ6的表達(dá)與甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切相關(guān)性。在這個(gè)意義上，檢測(cè)整合素αvβ6的