整合素ανβ6及CIP2A對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞惡性行為的調(diào)控作用.pdf

1、研究背景：
　　整合素αvβ6作為一種只在發(fā)生惡性病變的上皮組織中表達(dá)的粘附因子，目前在結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌以及口咽部癌中的研究已經(jīng)取得了重要的成果，尤其是在結(jié)腸癌方面的研究，更加深入細(xì)致;并且證實(shí)，αvβ6在上述惡性腫瘤中對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移方面起到重要的促進(jìn)作用。CIP2A是PP2A的癌性抑制因子。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CIP2A在胃癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、口腔癌(OSC

2、C)、前列腺癌、肝癌、宮頸癌、急慢性白血病、舌癌及關(guān)節(jié)炎等惡性腫瘤和增生中過表達(dá)，其與腫瘤發(fā)生具有良好的相關(guān)性。c-Myc是體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡及血管形成過程中起重要作用。c-Myc在人類多種癌癥形成過程中作為重要的致癌因子。一些研究表明c-Myc調(diào)節(jié)失控與多種腫瘤的形成有關(guān)。CIP2A直接與內(nèi)源性c-Myc的氨基端結(jié)合，在人類癌細(xì)胞中CIP2A通過抑制PP2A對(duì)c-Myc絲氨酸62位的去磷酸化作用進(jìn)而促進(jìn)c-My

3、c穩(wěn)定。結(jié)腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一，預(yù)后很差;目前在我國(guó)，其發(fā)病率及死亡率居全部惡性腫瘤前列。因此，尋找一種有效地治療結(jié)腸癌的手段，已成為醫(yī)學(xué)工作者迫在眉睫的任務(wù)。本研究即旨在研究αvβ6、CIP2A與c-Myc三者在結(jié)腸癌是否存在相互作用，并藉此尋求治療結(jié)腸癌的有效靶點(diǎn)。
　　第一部分、CIP2A與c-Myc在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及意義
　　目的：檢測(cè)蛋白質(zhì)磷酸酶2A(Protein phosphatae2A，PP2A)

4、的癌性抑制因子(Cancerous inhibitor of protein phosphatase2A，CIP2A)和c-Myc在結(jié)腸癌組織及正常結(jié)腸組織中的表達(dá)，分析二者在結(jié)腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性，探討CIP2A和c-Myc與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系。
　　方法：
　　選擇煙臺(tái)市煙臺(tái)山醫(yī)院80例結(jié)腸癌病人的手術(shù)病理標(biāo)本及20例正常結(jié)腸組織，制作組織芯片，行CIP2A與c-Myc的免疫組化染色;回顧性分析病人的臨床病例資料

5、，結(jié)合免疫組化結(jié)果，分析CIP2A與c-Myc在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)的相關(guān)性，分析CIP2A和c-Myc與結(jié)腸癌臨床病理資料之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.CIP2A在結(jié)腸癌組織中的整體表達(dá)率約為87.5％，明顯高于正常結(jié)腸組織(30％，P=0.000);其表達(dá)與病人的年齡、性別、腫瘤的大?。═分期）、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M分期）以及TNM分期無明顯關(guān)系（P值分別為0.866、0.864、0.856、0.636及0.973），而與

6、腫瘤的分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N分期）相關(guān)(P值分別為0.011、0.001)。
　　2.c-Myc在結(jié)腸癌組織中的整體表達(dá)率約為76.25％，明顯高于正常結(jié)腸組織(45％，P=0.006)。c-Myc表達(dá)同樣與病人的年齡、性別、腫瘤的大?。═分期）、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M分期）以及TNM分期無明顯關(guān)系(P值分別為0.59、0.623、0.843、0.173及0.759)，而與腫瘤的分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N分期）相關(guān)(P值分別為0

7、.002、0.001)。
　　3.在80例結(jié)腸癌組織中CIP2A與c-Myc表達(dá)呈正相關(guān)性(rk=0.411，P=0.009)。
　　結(jié)論及意義：
　　揭示了CIP2A與c-Myc在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況及其與各臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系，豐富了結(jié)腸癌研究的理論知識(shí)，并為靶向治療結(jié)腸癌的研究提供了確切的理論依據(jù)。
　　第二部分、整合素αvβ6在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及與CIP2A的相關(guān)性研究
　　目的：研究整合素α

8、vβ6在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，αvβ6與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系，以及αvβ6與CIP2A的相關(guān)性。
　　方法：
　　收集煙臺(tái)市煙臺(tái)山醫(yī)院80例結(jié)腸癌手術(shù)標(biāo)本及其病人的臨床病理資料，經(jīng)病理染色證實(shí)后構(gòu)建組織芯片，免疫組化方法檢測(cè)整合素αvβ6的表達(dá)，分析其表達(dá)與臨床病理資料間的關(guān)系，并進(jìn)一步研究整合素αvβ6與CIP2A蛋白的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　整合素αvβ6在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)率約為42.5％;其表達(dá)與

9、性別、年齡、腫瘤的大小、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系（P值分別為0.946、0.837、0.907及0.949），而與腫瘤的分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期相關(guān)（P值分別為0.006、0.019及0.002）。利用Kendall's tau-b等級(jí)相關(guān)性檢驗(yàn)得出，αvβ6與CIP2A在結(jié)腸癌組織的表達(dá)呈正相關(guān)（rk=0.248，P=0.011）。
　　結(jié)論及意義：
　　揭示了整合素αvβ6在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況及其與各臨床

10、病理特點(diǎn)之間的關(guān)系，明確了αvβ6和CIP2A在結(jié)腸癌組織的表達(dá)呈正相關(guān)，深化了關(guān)于整合素αvβ6的理論研究，并為以αvβ6為靶點(diǎn)進(jìn)行結(jié)腸癌靶向治療提供了可靠的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第三部分、整合素αvβ6在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡中的作用及Baicalin對(duì)αvβ6表達(dá)的影響
　　目的：探討整合素αvβ6在結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖和凋亡等惡性生物學(xué)行為中的作用及相關(guān)機(jī)制;研究Baicalin對(duì)結(jié)腸癌αvβ6表達(dá)的影響。

11、　　方法：
　　培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后分3組處理。對(duì)照組:不做特殊處理;10D5組:收集細(xì)胞重懸于RPMI1640中，向細(xì)胞懸液加入αvβ6單克隆抗體10D5，使其終濃度為0.1mg/mL，冰浴30min使其充分作用后置培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h，PBS清洗終止反應(yīng);IgG2a組:用10D5陰性對(duì)照劑鼠IgG2a以相同濃度處理，方法同10D5組。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blotting檢測(cè)caspase-

12、3蛋白的表達(dá)情況以研究整合素αvβ6在結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖和凋亡中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)MTT法檢測(cè)，用10D5封閉αvβ6后，細(xì)胞的存活率下降至（69.19±6.5）％（P＜0.05），而IgG2a處理組（98.25±1.4）％與對(duì)照組相比無明顯差異(P＞0.05)。
　　2.用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞并用WinMDI2.9軟件分析得出，對(duì)照組、10D5組、IgG2a組的凋亡率分別為（3.4±1.3）％、

13、（14.77±2.0）％、（3.08±0.6）％。10D5組細(xì)胞的凋亡率與對(duì)照組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); IgG2a組和對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　3.經(jīng)半定量光密度分析，caspase-3表達(dá)水平組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，10D5組表達(dá)水平大于對(duì)照組（P＜0.05）。IgG2a組與對(duì)照組相比，caspase-3表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　4.經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析，Baica

14、lin可顯著降低結(jié)腸癌αvβ6表達(dá)，并可能藉此發(fā)揮抗癌作用。
　　結(jié)論及意義：
　　結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞表面的αvβ6被特異性抗體封閉后，細(xì)胞增殖減慢，凋亡增加，caspase-3表達(dá)水平上調(diào)。表明αvβ6在HT-29細(xì)胞增殖和抗凋亡過程中發(fā)揮作用。另外，Baicalin可顯著降低結(jié)腸癌αvβ6表達(dá)。綜上，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了整合素αvβ6在結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖和凋亡等惡性生物學(xué)行為中的作用，簡(jiǎn)單探討了其作用機(jī)制，為結(jié)腸癌機(jī)制研