肝星狀細(xì)胞在肝癌細(xì)胞惡性行為中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：肝細(xì)胞性肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)的發(fā)生通常伴有慢性炎癥與纖維化，肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells，HSCs)在炎癥與纖維化過程中起到重要作用并構(gòu)成HCC的腫瘤微環(huán)境。
　　目的：共培養(yǎng)HSCs與HCC細(xì)胞，評價共培養(yǎng)體系中HCC細(xì)胞對靶向藥物Sorafenib的敏感性，并檢測共培養(yǎng)情況下HCC細(xì)胞表型是否存在變化。進(jìn)一步深入研究HSCs引起HCC細(xì)胞對Soraf

2、enib敏感性變化以及遷移侵襲能力變化的機(jī)制。
　　方法：應(yīng)用MTT法檢測共培養(yǎng)條件下HCC細(xì)胞對Sorafenib敏感性的變化，進(jìn)一步通過ELISA、Western Blotting、qPCR等方法檢測與HSCs共培養(yǎng)后HCC細(xì)胞內(nèi)可能導(dǎo)致Sorafenib敏感性變化的信號通路改變，并使用相應(yīng)靶點的抑制劑干擾共培養(yǎng)的作用進(jìn)行驗證。另一方面，Western Blotting、 qPCR方法檢測HCC細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白、基因變化，

3、劃痕愈合實驗、Transwell檢測HCC細(xì)胞遷移、侵襲能力，使用siRNA干擾可能引起EMT的靶點后檢測HCC細(xì)胞的EMT相關(guān)蛋白與遷移、侵襲能力。聯(lián)合HSCs建立裸鼠原位腫瘤模型，檢測肺轉(zhuǎn)移能力的變化。
　　結(jié)果：首先發(fā)現(xiàn)Sorafenib通過凋亡途徑抑制HCC細(xì)胞增殖，使用HSCs與HCC細(xì)胞共培養(yǎng)后，HCC細(xì)胞對Sorafenib的敏感性明顯降低并且凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、9、PARP有所減少，說明共培養(yǎng)引起HCC細(xì)

4、胞對Sorafenib的耐受。HSCs條件培養(yǎng)基中的HGF水平明顯升高，而且共培養(yǎng)后HCC細(xì)胞存活相關(guān)通路中AKT、STAT3被激活，外源性HGF作用于HCC細(xì)胞能夠引起Sorafenib耐受，AKT、c-Met抑制劑能夠抵消共培養(yǎng)引起的耐藥，而STAT3激活不受上述抑制劑影響。然而共培養(yǎng)體系中STAT3明顯激活，說明其激活可能由其他可溶性因子介導(dǎo)。抑制STAT3上游的JAK能夠抑制STAT3激活并同樣改善共培養(yǎng)引起的Sorafenib

5、耐藥，STAT3抑制劑S3I-201同樣可以增加Sorafenib敏感性。其次，HSCs與HCC細(xì)胞共培養(yǎng)引起HCC細(xì)胞形態(tài)變化，這種變化與EMT誘導(dǎo)因子TGF-β引起的形態(tài)改變類似，與HSC共培養(yǎng)后HCC細(xì)胞的遷移與侵襲能力有所增強(qiáng)，上皮表型相關(guān)蛋白E-Cadherin減少、間質(zhì)表型標(biāo)記物Vimentin增加，免疫熒光染色顯示共培養(yǎng)后HCC細(xì)胞Vimentin增加，而且mRNA變化與之一致，證實HSCs誘導(dǎo)HCC細(xì)胞發(fā)生了EMT。可能

6、引起EMT的信號通路關(guān)鍵蛋白p-AKT、p-STAT3均明顯增加，使用siRNA干擾這些靶點并檢測E-Cadherin發(fā)現(xiàn)干擾AKT、ERK均不能影響共培養(yǎng)導(dǎo)致的EMT現(xiàn)象，而只有干擾STAT3才能逆轉(zhuǎn)這一過程，并且干擾STAT3后HCC細(xì)胞的遷移侵襲能力減弱。HSCs條件培養(yǎng)基與HCC單獨(dú)培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基中的TGF-β水平無差別。IL-6刺激HCC細(xì)胞不能引起EMT發(fā)生，而鞘氨醇1磷酸(Sphingosine-1-phosphate，

7、S1P)刺激能夠引起HCC細(xì)胞內(nèi)STAT3持續(xù)激活并導(dǎo)致EMT。干擾S1P受體S1PR1能夠降低HCC細(xì)胞的遷移與侵襲能力，并且通過STAT3/Slug進(jìn)一步抑制共培養(yǎng)引起的EMT。同時注射HSCs能夠增加裸鼠原位HCC腫瘤的轉(zhuǎn)移能力。
　　結(jié)論：HSCs能夠通過分泌HGF激活HCC細(xì)胞內(nèi)的c-Met/AKT通路從而引起Sorafenib耐藥，另外HSCs還可通過激活JAK/STAT3引起Sorafenib耐藥，分別靶向這兩條通路