肝癌細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞相互作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf_第1頁
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1、研究目的:
  觀察肝癌細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞相互作用對(duì)二者生長狀態(tài)的影響,初步探討肝癌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的相互作用在肝癌發(fā)展過程中的作用,以期進(jìn)一步了解肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為,進(jìn)而為肝癌治療提供新思路。
  方法:
  以人肝癌HepG2細(xì)胞系和肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞系為研究對(duì)象,實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分:1、觀察HepG2細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)HSC增殖活化的影響;2、觀察活化HSC條件培養(yǎng)基對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響;3、觀察直接共培

2、養(yǎng)的HepG2細(xì)胞和HSC超微結(jié)構(gòu)改變。
  1、HepG2細(xì)胞和HSC-T6細(xì)胞的體外培養(yǎng)及傳代
  采用含青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml,10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng),隔天更換培養(yǎng)液,待細(xì)胞生長至80%-90%密度時(shí),0.25%胰蛋白酶消化,按1∶3的比例傳代。
  2、HepG2和HSC條件培養(yǎng)基的制備
  HepG2/HSC以3×104/ml的密度接種于含

3、10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中(各3瓶),分別收集12h、24h、48h的培養(yǎng)上清,經(jīng)0.22μm的微孔濾膜過濾,即獲得HepG2/HSC的12h、24h、48h條件培養(yǎng)基儲(chǔ)存液,–20℃保存?zhèn)溆谩?br>  3、觀察HepG2細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)HSC增殖活化的影響
  1)實(shí)驗(yàn)分為以下幾組:
 ?、賹?duì)照組:普通單獨(dú)培養(yǎng)的HSC細(xì)胞
  ②實(shí)驗(yàn)組1:HSC細(xì)胞加入12h不同濃度(1∶8、1∶4、1∶2)的HepG2

4、條件培養(yǎng)基
  ③實(shí)驗(yàn)組2:HSC細(xì)胞加入24h不同濃度(1∶8、1∶4、1∶2)的HepG2條件培養(yǎng)基
 ?、軐?shí)驗(yàn)組3:HSC細(xì)胞加入48h不同濃度(1∶8、1∶4、1∶2)的HepG2條件培養(yǎng)基
  2)MTT法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)及不同濃度的HepG2條件培養(yǎng)基對(duì)HSC增殖的影響
  3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度48h的HepG2條件培養(yǎng)基對(duì)HSC細(xì)胞周期的影響
  4)免疫組化法檢測(cè)不同濃度48h的HepG

5、2條件培養(yǎng)基對(duì)HSCα-SMA表達(dá)的影響
  4、觀察HSC條件培養(yǎng)基對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響
  1)實(shí)驗(yàn)分為以下幾組:
  ①對(duì)照組:普通單獨(dú)培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞
 ?、趯?shí)驗(yàn)組1:HepG2細(xì)胞加入12h不同濃度(1∶8、1∶4、1∶2)的HSC條件培養(yǎng)基
  ③實(shí)驗(yàn)組2:HepG2細(xì)胞加入24h不同濃度(1∶8、1∶4、1∶2)的HSC條件培養(yǎng)基
 ?、軐?shí)驗(yàn)組3:HepG2細(xì)胞加入48h不同濃

6、度(1∶8、1∶4、1∶2)的HSC條件培養(yǎng)基
  2)MTT法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)及不同濃度的HSC條件培養(yǎng)基對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響
  3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度24h的HSC條件培養(yǎng)基對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響
  4)免疫組化法檢測(cè)不同濃度24h的HSC條件培養(yǎng)基對(duì)HepG2細(xì)胞PCNA、PPARγ表達(dá)的影響
  5、電鏡觀察直接共培養(yǎng)HepG2和HSC的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變
  結(jié)果:
  1、H

7、epG2細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)HSC增殖活化影響
  1)MTT結(jié)果顯示:不同濃度12h、24h、48h的HepG2條件培養(yǎng)基對(duì)HSC均有促增殖作用,各濃度實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,細(xì)胞數(shù)均有顯著增加(P<0.05)。12h、48h的增殖曲線顯示作用強(qiáng)度與條件培養(yǎng)基濃度關(guān)聯(lián),呈上升變化。24小時(shí)的HSC增殖曲線隨條件培養(yǎng)基濃度的升高有所下降,但細(xì)胞增殖仍明顯高于對(duì)照組。
  2)FCM檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示:經(jīng)不同濃度48h的HepG2條

8、件培養(yǎng)基處理后,HSC的G0/G1期細(xì)胞比例下降,S期細(xì)胞比例上升,與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,增殖指數(shù)PI{(S+G2/M)/( G0/G1+S+G2/M)}升高。
  3)α-SMA免疫組化結(jié)果顯示:經(jīng)不同濃度48h的HepG2條件培養(yǎng)基作用后,HSC的α-SMA表達(dá)增強(qiáng),且與條件培養(yǎng)基濃度相關(guān)。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比有明顯差異(P<0.01)。
  2、HSC條件培養(yǎng)基對(duì)HepG2細(xì)胞增

9、殖的影響
  1)MTT結(jié)果顯示:不同濃度、不同時(shí)間HSC條件培養(yǎng)基對(duì)HepG2細(xì)胞均有促增殖作用。各時(shí)間點(diǎn)、各濃度實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,細(xì)胞數(shù)均有顯著增加(P<0.05),增殖曲線顯示作用強(qiáng)度與條件培養(yǎng)基時(shí)間和濃度關(guān)聯(lián),均呈上升變化。
  2)FCM檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示:經(jīng)不同濃度24h的HSC條件培養(yǎng)基處理后,HepG2的G0/G1期細(xì)胞比例下降,S期細(xì)胞比例上升,與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相

10、比,增殖指數(shù)PI升高。
  3)免疫組學(xué)結(jié)果顯示:經(jīng)不同濃度24h的HSC條件培養(yǎng)基處理后,HepG2細(xì)胞PCNA的表達(dá)增強(qiáng),PPARγ的表達(dá)減弱,兩種蛋白表達(dá)的增強(qiáng)與減弱均與條件培養(yǎng)基濃度相關(guān)。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,均有明顯差異(P<0.01)。
  3、直接共培養(yǎng)HepG2和HSC細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變
  HepG2和HSC直接共培養(yǎng)時(shí),HepG2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)增殖旺盛表現(xiàn),細(xì)胞核增大,核不規(guī)則,核仁增大、增多,核

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