肝癌細胞與成纖維細胞的相互作用對肝癌肺轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、研究背景和目的:
　　原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)第五大常見的惡性腫瘤，死亡率極高，嚴重威脅了人類的健康。我國的肝癌患者占世界的一半以上，且80％的患者處于中晚期，預后差。肝癌的主要致死原因是侵襲和轉(zhuǎn)移，而在肝癌的遠隔轉(zhuǎn)移中，肺轉(zhuǎn)移占主要部分?！胺N子-土壤”學說認為，腫瘤的轉(zhuǎn)移過程與腫瘤微環(huán)境關(guān)系密切。因此，進一步深入研究肝癌微環(huán)境對肝癌肺轉(zhuǎn)移的影響，對臨床靶向肺轉(zhuǎn)移的預防和治療具有潛在的重要意義。
　　腫瘤微環(huán)境是指腫瘤發(fā)生發(fā)展

2、過程中所處的內(nèi)環(huán)境，包括腫瘤細胞、成纖維細胞、免疫細胞、內(nèi)皮細胞和多種細胞因子等成分。腫瘤細胞與微環(huán)境中非腫瘤細胞之間的交互作用，是腫瘤細胞調(diào)控腫瘤微環(huán)境的重要過程，對腫瘤細胞的生存和發(fā)展有著極其重要的意義。在非腫瘤細胞中，成纖維細胞是主要成分，其活化形式即腫瘤相關(guān)成纖維細胞，能夠為腫瘤生長提供營養(yǎng)支持和多種活性因子，參與腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥等多個方面的調(diào)控。在腫瘤微環(huán)境中，除了細胞因子發(fā)揮作用之外，外泌體作為重要的信息媒介，成為

3、近年來研究的熱點。外泌體是細胞生成的一種直徑在30到100納米的囊泡，其內(nèi)包含有多種核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等物質(zhì)，是介導腫瘤微環(huán)境中多種細胞之間生物信息交流的重要介質(zhì)，在腫瘤的轉(zhuǎn)移、耐藥等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。
　　然而，在肝癌肺轉(zhuǎn)移過程中，肝癌細胞如何調(diào)控腫瘤微環(huán)境以促進肺轉(zhuǎn)移形成，目前尚不清楚。尤其是肝癌細胞與成纖維細胞之間交互作用對肺轉(zhuǎn)移形成的影響，以及肝癌微環(huán)境中外泌體對介導肝癌肺轉(zhuǎn)移過程的影響均無系統(tǒng)研究闡明。并且，肝癌

4、細胞在肺轉(zhuǎn)移形成能力上存在較大異質(zhì)性，這一點是否與肝癌細胞對微環(huán)境特別是成纖維細胞的教化能力不同有關(guān)，亦缺少相關(guān)研究證實。因此，深入研究肝癌細胞對微環(huán)境中成纖維細胞的調(diào)控及其機制，對理解肝癌肺轉(zhuǎn)移異質(zhì)性，在臨床治療及預后判斷方面具有重要價值。
　　本研究基于肝癌肺轉(zhuǎn)移存在異質(zhì)性這一現(xiàn)象，系統(tǒng)研究了不同轉(zhuǎn)移能力的肝癌細胞對成纖維細胞的教化能力差異，提出了高轉(zhuǎn)移肝癌細胞與成纖維細胞交互作用的具體機制。本研究將有助于進一步理解肝癌肺轉(zhuǎn)移

5、的具體過程，為臨床肝癌肺轉(zhuǎn)移的預防和治療提供新的思路。
　　研究方法:
　　1、選取常見四種肝癌細胞并通過尾靜脈注射建立體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移模型，根據(jù)肺轉(zhuǎn)移形成能力高低，分為高轉(zhuǎn)移肝癌細胞和低轉(zhuǎn)移肝癌細胞;
　　2、在體外，收集肝癌細胞條件培養(yǎng)基及外泌體，分別刺激人胚肺成纖維細胞，比較轉(zhuǎn)移能力差異對成纖維細胞招募及激活能力差異的影響，以及外泌體在肝癌細胞教化成纖維細胞過程的作用;
　　3、通過尾靜脈注射建立肝癌細胞SMMC

6、-7721的肺轉(zhuǎn)移模型，隨機分組后分別給予所選四種肝癌細胞的外泌體及對照處理，比較不同轉(zhuǎn)移能力肝癌細胞來源的外泌體對肝癌肺轉(zhuǎn)移的影響;
　　4、通過收集所選四種肝癌細胞的外泌體并進行miRNA芯片測試，分析其表達差異并結(jié)合功能實驗篩選高轉(zhuǎn)移肝癌細胞教化成纖維細胞過程中的關(guān)鍵miRNA;
　　5、通過miRNA靶點預測并結(jié)合功能實驗，篩選上述關(guān)鍵miRNA在成纖維細胞中發(fā)揮活化作用的直接靶點;
　　6、通過蛋白免疫印跡技

7、術(shù)及報告基因?qū)嶒?，進一步研究該miRNA在成纖維細胞中發(fā)揮作用的主要信號通路;
　　7、通過建立腫瘤相關(guān)成纖維細胞體外誘導模型，研究其對肝癌細胞干性、EMT及腫瘤生長的影響;
　　8、通過分離培養(yǎng)原代腫瘤相關(guān)成纖維細胞，研究其對肝癌細胞干性、EMT及腫瘤生長的影響;
　　9、收集臨床肝癌組織及血清樣本，檢測上述miRNA的臨床樣本中的表達情況及對臨床預后的相關(guān)性，分析血清外泌體中該miRNA的表達與肝癌肺轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

8、
　　結(jié)果:
　　1、高轉(zhuǎn)移能力的肝癌細胞具有更強的招募及活化成纖維細胞以促進肝癌肺轉(zhuǎn)移的能力;
　　2、高轉(zhuǎn)移肝癌細胞來源的外泌體具有更強的招募及活化成纖維細胞的能力，繼而促進肺轉(zhuǎn)移的形成;
　　3、高轉(zhuǎn)移肝癌細胞生成含有miR-1247-3p的外泌體介導了肺轉(zhuǎn)移微環(huán)境中的正常成纖維細胞的活化;
　　4、β1，4亞基半乳糖轉(zhuǎn)移酶3是腫瘤細胞教化成纖維細胞過程中miR-1247-3p的直接作用靶點;

9、　　5、miR-1247-3p通過靶向β1，4亞基半乳糖轉(zhuǎn)移酶3，繼而上調(diào)β1型整合素-NF-κB信號通路，以激活成纖維細胞;
　　6、活化后的成纖維細胞中IL-6和IL-8分泌能力增強，促進肝癌細胞的干性、EMT和腫瘤生長;
　　7、血清外泌體中miR-1247-3p的表達與肝癌肺轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)論:
　　本研究通過不同轉(zhuǎn)移能力肝癌細胞對成纖維細胞的教化實驗，發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移肝癌細胞具有更強的招募并激活成纖

10、維細胞的能力。具體機制為，高轉(zhuǎn)移肝癌細胞能特異性生成含有大量miR-1247-3p的外泌體，后者被成纖維細胞攝取后，miR-1247-3p通過靶向β1，4亞基半乳糖轉(zhuǎn)移酶3，進而上調(diào)β1型整合素-NF-κB信號通路，從而激活成纖維細胞。活化后的腫瘤相關(guān)成纖維細胞中IL-6和IL-8分泌能力增強，促進肝癌細胞的干性、EMT及腫瘤生長。在臨床肝癌患者的血清外泌體樣本中，miR-1247-3p的表達與肝癌肺轉(zhuǎn)移具有正相關(guān)關(guān)系。本研究證實了，在