細(xì)胞連接蛋白在肝星狀細(xì)胞活化中的作用.pdf

1、背景:肝硬化是進(jìn)展性肝纖維化的終末期，如果不加以預(yù)防，可能發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌和肝衰竭。在肝纖維化的進(jìn)展過程中起著核心作用的是肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化。當(dāng)前的研究主要集中在細(xì)胞因子促活化的作用上，已經(jīng)闡明諸多因子的分子機制，但是對細(xì)胞因子活化途徑的干預(yù)，對于抗纖維化的治療效果無法達(dá)到預(yù)期。而細(xì)胞間接觸和連接是活化后的HSC的重要表現(xiàn)，本課題組之前的研究也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞接觸與非接觸共培養(yǎng)，HSC會

2、表現(xiàn)出不同的活化狀態(tài)，因此，肝硬化發(fā)病新的機制的探索將有助于肝纖維化的治療取得突破。
　　目的:通過將靜止的肝星狀細(xì)胞與活化的肝星狀細(xì)胞進(jìn)行接觸培養(yǎng)與非接觸共培養(yǎng)進(jìn)行對照，觀察細(xì)胞間連接蛋白CX-43表達(dá)及阻斷后對肝星狀細(xì)胞活化的影響，從而揭示其對HSC活化的作用。
　　方法:1.通過蛋白酶，膠原酶，后分散液序貫灌注的方法灌注雄性S-D大鼠的肝臟，分散肝臟細(xì)胞并使之消化，再通過密度梯度離心，和細(xì)胞的貼壁時間的差異性，得到分離

3、的肝星狀細(xì)胞，并且量子點標(biāo)記。將分離得到的大鼠的的原代HSC（靜止表型），與HSC-T6細(xì)胞株（活化表型）依照一定的比值接種在提前用Matrigel膠包被的transwell體系內(nèi)。分組:非阻滯劑組分為:A組（非接觸共培養(yǎng)組）:上室接種1.3×105個/ml，接種2ml的HSC-T6細(xì)胞，下室接種1.3×105個/ml，接種2ml的原代HSC。B組（接觸共培養(yǎng)組）:將原代HSC1.3×105個/ml與HSC-T6細(xì)胞株1.3×105個/

4、ml按照1∶1混懸，上室和下室各接種2ml混懸液。C組（陰性對照度）:上室和下室均加入1.3×105個/ml，接種2ml。阻滯劑組:記為Bi組，將原代HSC1.3×105個/ml與HSC-T6細(xì)胞株1.3×105個/ml按照1∶1混懸，上室和下室各接種2ml混懸液，并且加入CX-43阻滯劑gap26.
　　2.觀察指標(biāo):通過免疫熒光技術(shù)觀察24h，48h各分組α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)在原代HSC中的表達(dá)量，反映細(xì)胞活化狀況

5、，并觀察原代HSC中細(xì)胞連接蛋白-43（CX-43）的表達(dá)量，以此來驗證CX-43與HSC活化是否具有一定的關(guān)系。
　　結(jié)果:非阻滯劑組α-SMA:A組:原代HSC24h，48h均未活化，不表達(dá)α-SMA。B組:原代HSC24h已經(jīng)開始活化，48h明顯活化，從24h的表達(dá)少量的α-SMA，到48h表達(dá)大量的α-SMA，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)上觀察，已經(jīng)發(fā)生顯著變化，如細(xì)胞體積增大，胞突延伸展開，偽足伸出。C組:原代HSC細(xì)胞24h和48h全

6、都沒有發(fā)生活化，不表達(dá)α-SMA。阻滯劑組:Bi組，原代HSC24h尚未活化，不表達(dá)α-SMA。非阻滯劑組CX-43:A組:原代HSC24h，48h均未活化，不表達(dá)CX-43，B組:原代HSC24h已經(jīng)開始活化，表達(dá)少量的CX-43，48h明顯活化，細(xì)胞體積增大，胞突延伸展開，伸出偽足，表達(dá)大量的CX-43。C組:原代HSC24h和48h均未活化，不表達(dá)CX-43。阻滯劑組:B1組，原代HSC24h尚未活化，不表達(dá)CX-43。