RKIP在肝星狀細胞粘附過程中的作用.pdf

1、肝纖維化是慢性肝病發(fā)展為肝硬化乃至肝功能衰竭的病理基礎，因而，阻止肝纖維化發(fā)生這一過程已經(jīng)成為國內(nèi)外研究慢性肝病的中心議題。在這一過程中細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的生成和降解失衡，其量和質(zhì)發(fā)生變化，從以Ⅳ型膠原組成為主，變?yōu)橐岳w維膠原組成為主(如Ⅰ型、Ⅲ型膠原)。由此肝臟的質(zhì)地、韌度及血流動力學發(fā)生改變，使肝功能出現(xiàn)異常，并且可能引起多種并發(fā)癥。
　　肝星狀細胞(Hepatic stellate

2、 cells，HSCs)在肝纖維化過程中被激活并轉化為肌成纖維細胞，生成細胞外基質(zhì)及一系列生長因子、促炎因子，這奠定了HSCs在肝纖維化過程中的中心地位。因此，干預HSCs、影響其生物學行為是阻斷、減輕甚至逆轉肝纖維化的研究切入點。
　　Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein，RKIP)是1999年被Yeung K等利用酵母雙雜交篩選法分離出的一種Raf激酶抑制蛋白，它可以與Raf-1結合抑制

3、其磷酸化MEK，從而抑制Raf-1/MEK/ERK1，2信號通路的激活，進而可以影響HSCs的增殖分化等生物學行為。近年來RKIP在癌癥中的功能和作用研究較多，同時國內(nèi)有研究證實RKIP可以抑制HSCs細胞的增殖，促進HSCs的細胞遷移。本研究我們將揭示RKIP在HSCs粘附過程中的作用。
　　目的：本文主要通過RKIP過表達及RNAi技術，模擬不同生理病理狀態(tài)下ECM成分的改變，探討RKIP對HSCs粘附功能的影響。
　　

4、方法：實驗LX-2細胞共分四組，分別是RKIP過表達組(RKIP-Ad)及陰性對照組(GFP-Ad)；應用用RNAi技術的RKIP抑制組(RKIP-RNAi-Ad)及陰性對照組(NC-GFP-Ad)。首先確定細胞感染病毒的最適MOI(multiplicity of infection)值：體外培養(yǎng)傳代LX-2細胞株，72 h傳代一次。當細胞融合至80％左右時開始給予感染病毒，MOI值設四個水平，分別是5、10、15、20。于12 h、2

5、4 h、48 h時在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，計數(shù)細胞熒光數(shù)，通過流式細胞術進行感染率的驗證，篩選出最適MOI值及感染時間。其次確定感染病毒后是否確有RKIP的過表達和抑制：以最適MOI值及感染時間感染細胞，Western Blot方法驗證各組RKIP表達情況。應用透射電鏡觀察細胞間連接。已干預好的細胞稀釋成1.0×105/ml的濃度種在蓋玻片和已準備好的由Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原、matrigel及fibronectin包被的24孔板中

6、，每種干預設3個復孔，1 h后200×下取12個視野計數(shù)粘附的細胞數(shù)，資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示，進行統(tǒng)計分析。
　　結果：
　　1.人HSCs LX-2細胞株的腺病毒感染率可達到80％～90％。適宜的MOI值為5，感染時間為48 h。感染時間過短，熒光表達率低；MOI值過大則細胞毒性過大，細胞狀態(tài)變差，甚至碎裂。
　　2.RKIP過表達組較對照組蛋白表達增多(3.47±0.02 vs1.74±0.13，P<

7、0.05，n=3)。RKIP抑制組較對照組蛋白表達明顯減少(0.29±0.06 vs0.73±0.14，P<0.05，n=3)。
　　3.RKIP過表達促進HSCs在glass上的粘附，過表達組和抑制組的粘附細胞數(shù)分別為(158±68 vs81±12，P<0.05，n=12)。RKIP的低表達，抑制其在glass上的粘附(83±10 vs131±43，P<0.05，n=12)；RKIP在HSCs與基質(zhì)的粘附上的作用與在glass上

8、的作用相反。RKIP的過表達抑制HSCs與matrigel、Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原及纖維連接蛋白的粘附。Matrigel上RKIP過表達組與對照組分別為(80±14 vs152±42，P<0.05，n=12)；Ⅰ型膠原上為(70±13 vs138±36，P<0.05，n=12)；Ⅳ型膠原(92±6 vs124±32，P<0.05，n=12)；纖維連接蛋白(133±27 vs276±106，P<0.05，n=12)；而RKIP的抑制組促進HS

9、Cs與以上基質(zhì)的粘附，Matrigel基質(zhì)膠表面的粘附為(170±25 vs66±12，P<0.05，n=12)；Ⅰ型膠原表面粘附為(200±25 vs82±13，P<0.05，n=12)；Ⅳ型膠原為(167±22 vs96±14，P<0.05，n=12)；纖維連接蛋白為(276±28 vs96±17，P<0.05，n=12)。
　　結論：RKIP在肝星狀細胞粘附的過程中發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用：RKIP促進HSCs在glass上的粘附