Tmem88在肝星狀細胞中的重要作用及相關(guān)機制研究.pdf

1、肝纖維化（hepatic fibrosis, HF）是一種由多種致肝損傷的因子（例如：HBV或HCV感染、酒精濫用、高脂飲食等）引起的損傷修復反應。肝星狀細胞（hepatic stellate cell, HSC)的活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，抑制肝星狀細胞的活化及增殖是肝纖維治療的主要策略之一。Wnt/β-catenin通路的激活不僅是肝星狀細胞活化的重要標志，并且能夠顯著地促進肝星狀細胞的活化和增殖?？缒さ鞍?8(Transm

2、embrane protein88，Tmem88)是一種雙跨膜的蛋白，在人心肌細胞以及非洲爪蟾的胚胎細胞的研究中發(fā)現(xiàn)其能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化。Tmem88能否通過阻礙Wnt/β-catenin通路的活化來抑制肝星狀細胞的活化與增殖，從而阻礙肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，還未見文獻報道。
　　為研究Tmem88在肝纖維化進程中的作用，課題組檢測Tmem88在人肝纖維化組織、小鼠原代肝星狀細胞以及活化的HSC-T6細胞

3、中的表達變化；通過分別過表達和沉默HSC-T6細胞中的Tmem88，檢測Tmem88對于肝星狀細胞的活化、增殖及凋亡的影響；通過檢測Tmem88基因的甲基化狀態(tài)，探討其表達的調(diào)控機制，并進一步探究了3種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶對其表達的調(diào)控作用。本文主要研究內(nèi)容包括下面4個部分：
　　1. Tmem88在人肝纖維化組織、小鼠原代肝星狀細胞以及活化的HSC-T6細胞中的表達變化
　　臨床標本：從臨床收集新鮮的人肝癌組織，HE和Mas

4、son染色觀察肝臟病理改變，根據(jù)病理分級，將肝組織分為對照組（Control）和纖維化組（Fibrosis）。分別提取肝纖維化組織以及對照組肝組織，應用Western Blot、免疫組化技術(shù)檢測Tmem88的表達變化。結(jié)果顯示：Tmem88在人肝纖維組織中的表達顯著降低。
　　動物實驗：將24只C57BL/6小鼠（雄性，20~22g）隨機分為對照組（Control）和肝纖維化模型組（CCL4），每組12只。模型組小鼠背部皮下注射2

5、0%CCL4橄欖油溶液，每周2次，持續(xù)4周；對照組給予相同劑量的橄欖油溶液。停止注射CCL4后的第二天分別處死對照組和模型組中的小鼠，收集血清、肝臟標本以及原代的肝星狀細胞待用。H&E染色和Masson染色觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)的病理變化，生化指標檢測血清ALT和AST水平。免疫熒光雙染、免疫組化、QPCR以及Western Blot檢測Tmem88的定位和表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）小鼠肝纖維化模型建立成功；（2）Tmem88主要表達于小鼠的

6、肝星狀細胞中；（3）Tmem88在肝纖維化小鼠的原代肝星狀細胞中表達下降。
　　細胞實驗：HSC-T6細胞經(jīng)10ng/ml的TGF-β1刺激活化24h后，分別采用QPCR和Western Blot技術(shù)檢測Tmem88在活化的HSC中的表達變化。結(jié)果顯示：Tmem88在TGF-β1誘導活化的HSC-T6細胞中表達顯著降低。
　　2.過表達Tmem88對HSC-T6細胞活化、增殖以及凋亡的影響
　　應用QPCR和Weste

7、rn Blot技術(shù)檢測HSC-T6中活化標志蛋白（Col1α1和α-SMA）的表達變化，明確過表達Tmem88對HSC-T6細胞活化的影響；其次運用MTT檢測HSC-T6細胞的細胞活力變化，流式細胞儀檢測細胞周期分布，明確過表達Tmem88對HSC-T6細胞增殖的影響；應用Western Blot技術(shù)檢測過表達Tmem88對HSC-T6細胞中的Wnt/β-catenin活化的影響；應用流式細胞儀檢測細胞凋亡的分布，Western Blo

8、t技術(shù)檢測HSC-T6中凋亡相關(guān)蛋白（Caspase3、Bcl-2和Bax）的表達變化，明確過表達Tmem88對HSC-T6細胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：過表達Tmem88可以逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導的HSC-T6細胞活化，通過阻礙Wnt/β-catenin通路活化能夠抑制TGF-β1誘導的HSC-T6的增殖并使細胞周期阻滯在G0/G1期，并且能夠促進活化的HSC-T6細胞的凋亡。
　　3.沉默Tmem88對HSC-T6細胞活化、增殖以及

9、凋亡的影響
　　應用QPCR和Western Blot技術(shù)檢測HSC-T6中活化標志蛋白（Col1α1和α-SMA）的表達變化，明確沉默Tmem88對HSC-T6細胞活化的影響；應用Western Blot技術(shù)檢測沉默Tmem88對HSC-T6細胞中的Wnt/β-catenin通路活化的影響；應用Western Blot技術(shù)檢測HSC-T6中凋亡相關(guān)蛋白（Caspase3、Bcl-2和Bax）的表達變化，明確沉默Tmem88對HS

10、C-T6細胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：沉默Tmem88可以促進TGF-β1誘導的HSC-T6細胞活化，強化Wnt/β-catenin通路的活化，并且能夠抑制活化的HSC-T6細胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達。
　　4. DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶對Tmem88表達的影響
　　RRBS篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tmem88基因的甲基化程度在肝纖維化小鼠的原代肝星狀細胞中是正常對照小鼠的158倍。在卵巢癌的研究中也發(fā)現(xiàn)Tmem88的蛋白表達與其基因啟動子區(qū)域的甲

11、基化狀態(tài)相關(guān)。課題組進一步觀察了Tmem88的甲基化調(diào)控機制。課題組應用了DNA甲基化抑制劑5-AzadC（2umol/L）處理TGF-β1誘導活化的HSC-T6細胞，應用Western Blot技術(shù)分別檢測Tmem88以及活化標志蛋白（Col1α1和α-SMA）的表達變化；提取小鼠原代肝星狀細胞以及活化的HSC-T6細胞中的蛋白，應用Western Blot技術(shù)檢測三種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b）的表達