細胞連接相關蛋白在皮膚低溫損傷中的重要作用及低溫保護劑的相關研究.pdf

1、研究背景及目的：低溫保存是低溫生物學研究中的一項重要技術，而細胞和組織保存的關鍵問題是解決低溫損傷作用。低溫保存的實踐發(fā)現(xiàn)，當組織細胞以單細胞懸液的形式冷凍保存時可以保持更高的活力。最新的研究表明，細胞內的骨架系統(tǒng)對低溫保存是不利的，原因可能是其與細胞膜的錨著限制了細胞對滲透壓變化的適應性。而對于組織來說，其細胞間連接對細胞間的錨著則進一步加強了細胞骨架對細胞的固定作用，使其運動和形狀變化受到更大的限制，因此對冷凍刺激更為敏感。由此可以

2、認為細胞連接是組織低溫保存過程中產生損傷的關鍵部位，其原因與其限制了細胞對體積劇烈變化的順應性有關。本研究的目的旨在研究皮膚低溫儲存與細胞連接相關蛋白的變化，從而分析其低溫生物學效應，并將幾種低溫保護劑(CPA)進行比較，以期為探索低溫組織保存液的有效成分提供科學依據。 方法：第一部分實驗中，將皮膚組織采用不同的溫度組(4℃組、-20℃組、-80℃組和-196℃組)進行保存，并在保存7天、14天、21天、28天后進行實驗觀察，設

3、新鮮皮膚為對照組。參與細胞連接及信號轉導的相關蛋白主要有：α-輔肌動蛋白(α-actinin)、紐蛋白(vinculin)。首先通過HE染色和免疫組織化學染色兩種病理學方法在光鏡下觀察細胞形態(tài)和蛋白的改變，并用圖像分析儀測定表皮組織中的含量變化。進一步采用RT-PCR和Western-blot對不同方法保存后的α-actinin、vinculin的含量進行了深入研究。力求從細胞連接結構的重要組成部分中尋找到低溫損傷的位點，從而更深入了解

4、抗低溫損傷的機理。 第二部分從海藻糖對皮膚細胞連接相關蛋白的保護作用入手，探討一種新型的CPA對低溫儲存皮膚活力的影響。實驗將新鮮成人皮膚分為4組，分別經海藻糖/二甲基亞砜(T/D)、二甲基亞砜/丙二醇(D/P)、二甲基亞砜/去血清角質細胞培養(yǎng)液(D/K)、DMEM作為低溫保護劑保存，-196℃液氮凍存7天、14天復溫，設新鮮皮膚為對照組。采用組織病理HE染色、免疫組織化學染色、琥珀酸脫氫酶(SDH)測定方法，對各組間皮膚活力進

5、行比較。并在此基礎上，進一步采用RT-PCR和Western-blot方法對不同低溫保護劑保存后皮膚的vinculin、α-actinin蛋白含量和基因水平進行了深入的研究。 結果： 1、皮膚組織低溫儲存后其細胞連接相關蛋白vinculin、α-actinin形態(tài)結構及分布改變，并且蛋白含量下降，它們可能是低溫損傷皮膚細胞連接結構的作用位點。 2、應用不同的溫度儲存皮膚得到不同的保存效果，在-196℃保存時細胞連

6、接相關蛋白含量下降較少，形態(tài)改變不顯著。 3、隨著保存時間的延長，低溫對細胞連接相關蛋白的損傷作用愈顯著，-196℃組所保存的皮膚中細胞連接相關蛋白含量亦逐漸下降。 4、通過蛋白分析結果及皮膚活力的測定表明，海藻糖在低溫保存過程中，保護皮膚組織細胞連接相關蛋白，其中vinculin、α-actinin的蛋白含量和基因表達量與新鮮皮膚組相似。 5、海藻糖/二甲基亞砜組具有提高低溫保存皮膚活力的作用，并優(yōu)于傳統(tǒng)保護劑