動力相關(guān)蛋白1在膿毒癥心肌損傷中的作用及其機制研究.pdf

1、背景：膿毒癥(sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應綜合征，膿毒癥的全球發(fā)病率很高。嚴重膿毒癥患者會出現(xiàn)不同程度的心功能下降，并增加患者死亡風險。線粒體功能紊亂是膿毒癥時引起心肌細胞不可逆轉(zhuǎn)的損害的主要原因。近年來研究表明，心臟線粒體分裂融合的動態(tài)平衡狀態(tài)在維持心臟線粒體正常生理狀態(tài)中具有重大的作用。而大量研究表明，在心肌缺血再灌注損傷、心力衰竭、高血壓、糖尿病心肌病、動脈粥樣硬化等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中，線粒體分裂融合的動態(tài)平衡

2、紊亂起了至關(guān)重要的作用。動力相關(guān)蛋白1(dynamin-related peptide1，Drp1)是參與線粒體分裂過程中的一種關(guān)鍵蛋白。Drp1是否參與了膿毒癥心肌損傷作用尚不明了。
　　目的：本實驗將從整體和細胞水平入手研究膿毒癥時Drp1在心肌損傷中的作用和作用機制;并探討在膿毒癥時，IL-6和TNF-α哪個是導致Drp1改變的主要炎癥因子。
　　方法：
　　1) SD大鼠腹腔注射LPS建立膿毒癥模型，測定大鼠生

3、存率。
　　2)心臟超聲檢查測定大鼠心功能。
　　3)提取心肌組織總蛋白和線粒體蛋白，測定各組分中Drp1、Drp1 S637、Drp1 S616、CaMKⅡ、p-JNK、Rac1/Cdc42、RhoA蛋白水平。
　　4) ELISA法測定大鼠血清中炎癥因子（LPS、TNF-α、IL-6）濃度。
　　5)透射電鏡觀察大鼠心臟線粒體形態(tài)。
　　6)激光共聚焦顯微技術(shù)觀察心肌細胞線粒體形態(tài)。
　　結(jié)果：<

4、br>　　1) SD大鼠腹腔注射不同濃度LPS（5、10、20mg/kg）后，每搏輸出量和心輸出量開始下降;線粒體片段化程度增加。
　　2)SD大鼠給予不同濃度LPS(5、10、20mg/kg)腹腔注射后6h，心肌組織總Drp1水平無明顯變化，但線粒體Drp1量隨著LPS濃度的增高明顯增加。提示，膿毒癥心肌組織中Drp1發(fā)生了線粒體轉(zhuǎn)位。
　　3) SD大鼠腹腔注射LPS(20mg/kg)后，大鼠死亡率達70％;而Drp1的

5、特異性抑制劑Mdivi-1(1mg/kg，i.p.)可明顯抑制LPS誘導的心肌每搏輸出量和心輸出量的下降，并降低大鼠死亡率。
　　4)不同濃度LPS注射后6h，發(fā)現(xiàn)心肌組織中磷酸化Drp1 S637蛋白水平無明顯變化，但磷酸化Drp1 S616蛋白水平明顯增加。
　　5)SD大鼠腹腔注射LPS（20mg/kg）后，血清中炎癥因子LPS、TNF-α、IL-6濃度明顯增加。LPS（0.01、0.1或1μg/mL）、TNF-α（5

6、、10或20ng/mL）、IL-6（5、10或20ng/mL）孵育H9C2細胞48h后，可濃度依賴性降低細胞的生存率。
　　6)LPS(1μg/mL)、IL-6(20ng/ml)對H9C2細胞總Drp1和線粒體drp1水平無明顯影響。TNF-α(20ng/ml)對H9C2細胞Drp1總量無明顯影響，但TNF-α孵育細胞后，Drp1 Ser616位點的磷酸化和線粒體Drp1水平明顯增加。
　　7)TNF-α（20ng/ml）處

7、理H9C2細胞后，可明顯增加CaMKⅡ的表達。但CaMKⅡ的抑制劑KN-93不能明顯抑制TNF-α誘導的Drp1的磷酸化和線粒體轉(zhuǎn)位，同時對TNF-α誘導的心肌細胞死亡也沒有明顯影響。
　　8)TNF-α（20ng/ml）處理H9C2細胞后，對細胞p-JNK、Rac1/Cdc42無明顯影響，但RhoA蛋白表達明顯增加。ROCK1和ROCK2的特異性抑制劑Y-27632和Fasudil可明顯抑制TNF-α的Drp1的磷酸化和線粒體轉(zhuǎn)