PP2A-PLD1在多發(fā)傷膿毒癥分子機制中作用的研究.pdf

1、背景:
　　膿毒癥(sepsis)是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatory response syndrome， SIRS)，臨床上證實有細菌存在或有高度可疑感染灶。革蘭陰性菌感染后數(shù)小時即可發(fā)生膿毒癥性休克，主要表現(xiàn)為血壓急劇下降、發(fā)熱、腹瀉與彌散性凝血等癥狀。在臨床上，膿毒癥導致的膿毒癥性休克是重癥監(jiān)護患者最常見的死亡原因，死亡率可達20％～80％。多發(fā)傷患者一旦出現(xiàn)膿毒癥、多器官功能障礙等

2、并發(fā)癥，往往預(yù)后較差。創(chuàng)傷（多發(fā)傷）并發(fā)的膿毒癥是眾多學者及實驗室近年研究的熱門課題之一，雖然國際上早就提出膿毒癥診斷的PIRO分級系統(tǒng)概念，但患者發(fā)生膿毒癥的病因、背景（如年齡、基礎(chǔ)疾病或基礎(chǔ)狀態(tài)）等的不同，影響因素多樣復雜，使得膿毒癥分子機制仍未能完全闡明。目前，膿毒癥機制研究涉及到復雜的全身炎癥網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)、基因多態(tài)性、免疫功能障礙、凝血功能異常、組織損傷以及宿主對不同感染病原微生物及其毒素的異常反應(yīng)等多個方面，與機體多系統(tǒng)、多器官病

3、理生理改變密切相關(guān)。
　　蛋白質(zhì)磷酸酶-2A(protein phosphatae2A，PP2A)是真核生物體內(nèi)的主要絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，在結(jié)構(gòu)上擁有很多不同基因編碼的亞基，并且分別組成多種不同的PP2A全酶，參與到細胞周期、DNA復制、信號轉(zhuǎn)導、細胞分化和細胞惡性轉(zhuǎn)化等多種細胞生物學事件，目前在酵母，果蠅和小鼠等生物學模型的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PP2A在細胞周期調(diào)控，形態(tài)以及發(fā)育中的作用，同時它又在信號轉(zhuǎn)導的級聯(lián)反應(yīng)中與其他磷酸化酶

4、和激酶相互作用，構(gòu)成調(diào)節(jié)大分子調(diào)控下游信號的轉(zhuǎn)導，也可以通過可逆性磷酸化使已磷酸化激活的蛋白質(zhì)脫磷酸，在信號傳導中承擔負性調(diào)節(jié)的作用。國外已有學者認為PP2A是關(guān)鍵性的炎癥細胞信號內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，并且在膿毒癥引起的血管內(nèi)皮細胞功能障礙分子機制中發(fā)揮重要作用，是有實用價值的治療膿毒癥的藥理作用靶點。
　　磷脂酶D(phospholipase D，PLD)分1-2型普遍存在于細菌、真菌以及哺乳動物中。在病原微生物中，PLD作為毒力決定

5、因子在減數(shù)分裂、孢子形成等過程中起作用;在哺乳動物細胞中，PLD主要在胞膜轉(zhuǎn)運、調(diào)節(jié)有絲分裂和細胞肌動蛋白骨架等一些信號轉(zhuǎn)導中起作用。在病原菌感染宿主細胞的過程中，病原體和宿主細胞的PLD都被激活并發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，病原菌PLD可調(diào)節(jié)自身肌動蛋白絲的聚合和重排，并引起宿主細胞局部肌動蛋白絲的集聚，誘導宿主細胞對其吞噬。深入探討PLD激活對感染發(fā)生的調(diào)控作用對透徹理解病原菌感染宿主細胞的分子機制具有重要意義。國外對PLD1在膿毒癥分子機制中的

6、作用的研究已展開。
　　C-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal Kinase，JNK)信號通路是絲裂原激活的蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)中重要的通路之一，它位于胞質(zhì)，包含雙磷酸化功能區(qū)（由三種氨基酸Thr、Pro和Tyr組成）與c-junN端的活化區(qū)結(jié)合并使其第63、73位絲氨酸殘基磷酸化，JNK的活化是通過其氨基末端殘基磷酸化實現(xiàn)的，一旦被激活，胞漿中的JNK

7、移位到細胞核中。JNK信號通路在細胞周期、生產(chǎn)、凋亡和細胞應(yīng)激等多種生理和病理過程中起重要作用。物理、化學因素引起的細胞外環(huán)境變化及致炎細胞因子調(diào)節(jié)此通路。在嚴重感染，特別是在膿毒癥期，相關(guān)資料顯示JNK信號通路受到抑制，使機體清除有害物質(zhì)能力下降，損害加重。
　　從目前資料來看，國外學者傾向認為PP2A、PLD1在膿毒癥分子機制中可能抑制JNK信號傳導通路，從而抑制相關(guān)細胞因子的表達而導致宿主感染過程加重。但上述研究均在人為控制

8、條件的細胞株及動物模型上完成，至今無人在膿毒癥實例中驗證相關(guān)理論，故上述研究結(jié)論的可靠性及意義受到一定影響。此外，PP2A、PLD1在膿毒癥分子機制中關(guān)聯(lián)性研究仍未見報道。
　　目的:
　　本研究旨在通過對合并膿毒癥的多發(fā)傷患者血液中粒細胞PP2A、PLD1表達、活性及定量變化分析，同時驗證PP2A/PLD1與JNK信號通路的關(guān)聯(lián)性，為進一步完善膿毒癥分子機制提供一種新的途徑和補充。
　　方法:
　　1.檢測24

9、例膿毒癥多發(fā)傷患者、22例非膿毒癥多發(fā)傷患者發(fā)病第1d、7d及15例正常人血液中PP2A與c-jun/JNKmRNA水平及蛋白表達情況。并結(jié)合每位患者的重癥監(jiān)護室(Intensive care unit，ICU)住院天數(shù)(Length of stay, LOS)、序貫臟器衰竭評分系統(tǒng)（Sequential Organ Failure Assessment, SOFA）和多器官功能衰竭（Multiple Organ Dysfunction

10、，MOD）分數(shù)，將各變量兩兩之間進行相關(guān)性分析。同時，利用受試者工作特征曲線(Receiver-operating-characteristic，ROC)分析PP2A對膿毒癥的診斷效率。
　　2.將膿毒癥患者血液中粒細胞PP2A、PLD1、JNK蛋白表達與健康志愿對照者進行對比，觀察是否存在某種關(guān)聯(lián)性。
　　3.利用人單核細胞白血病細胞株（Human acute monocytic leukemia，THP-1），經(jīng)脂多糖(

11、Lipopolysaccharide，LPS)刺激，模擬膿毒癥環(huán)境，應(yīng)用蛋白免疫印跡法(Western-blot，WB)、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）技術(shù)，檢測PP2A、PLD1及JNK的表達并測定JNK活性及三者之間的相互作用。
　　4.利用LPS刺激THP-1細胞后，采用siRNA(Small interfering RNA)阻斷PP2A表達，檢測JNK信號通路、JNK活性及PLD1表

12、達，以進一步說明三者在通路中可能的關(guān)聯(lián)性。
　　結(jié)果:
　　1.膿毒癥患者PP2A的蛋白及mRNA表達高于非膿毒癥患者或健康對照者。此外，c-jun/JNK蛋白及mRNA表達隨著PP2A表達增高而明顯減弱。在發(fā)病的第1d、7d，PP2A表達與LOS、SOFA和MOD分數(shù)呈正相關(guān)。ROC曲線分析提示，在本次實驗中，PP2A分辨膿毒癥與非膿毒癥的敏感度是87.5％。
　　2.檢測膿毒癥患者與健康對照者PP2A、PLD1、J

13、NK蛋白表達，在健康對照組中PLD1、JNK表達正常，而PP2A表達減弱或消失。在膿毒癥組中則相反，PP2A明顯表達，對應(yīng)PLD1、JNK表達明顯減弱或消失。提示三者在膿毒癥中可能存在一定關(guān)聯(lián)性。
　　3.在THP-1細胞株中，利用Co-IP檢測了PP2A、PLD1及JNK三者關(guān)系，結(jié)果顯示三者之間存在著相互作用，同時發(fā)現(xiàn)JNK活性在細胞株感染了LPS后下降，提示三者在膿毒癥發(fā)生機制中共同發(fā)揮作用。
　　4.經(jīng)LPS感染的T

14、HP-1細胞株，利用siRNA阻斷PP2A表達后，PLD1、JNK蛋白表達及JNK活性恢復。
　　結(jié)論:
　　1.在膿毒癥中，PP2A負性調(diào)節(jié)JNK信號通路，是潛在的生物標志物。
　　2.在膿毒癥中，PP2A、PLD1、JNK三者相互作用存在一定關(guān)聯(lián)性。
　　3.在膿毒癥期，JNK信號通路受抑制與蛋白PP2A、PLD1所起的作用有關(guān)聯(lián)。其中，蛋白PP2A發(fā)揮主導作用?？赡艽嬖谝粭l由PP2A介導，PLD1參與調(diào)節(jié)J