Nrf2在膿毒癥T淋巴細(xì)胞鐵死亡中的作用研究.pdf

1、目的:本課題的研究目的為通過盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP法)建立小鼠膿毒癥模型，檢測T淋巴細(xì)胞內(nèi)鐵死亡重要指標(biāo)隨膿毒癥嚴(yán)重程度的變化情況，研究T淋巴細(xì)胞鐵死亡與膿毒癥的關(guān)系及Nrf2在膿毒癥T淋巴細(xì)胞鐵死亡中的作用。
　　方法:雄性C57BL/6j小鼠共計(jì)51只，分為:生存分析組、假手術(shù)（對照）組、輕度膿毒癥組、重度膿毒癥組。生存分析組繼續(xù)分為假手術(shù)亞組、輕度膿毒癥亞組、重度膿毒癥亞組，觀察各時(shí)間點(diǎn)小鼠的表現(xiàn)及生存情況。假手術(shù)組小鼠在中

2、下腹部腹中線做切口，暴露腹腔，找到盲腸后不做處理立即將盲腸回納腹腔，關(guān)腹縫合。輕度膿毒癥組、重度膿毒癥組分別在找到盲腸后在距離盲腸遠(yuǎn)端1/3和2/3交接點(diǎn)處結(jié)扎盲腸和部分血管，再用27G針頭貫穿扎孔3次后回納腹腔，關(guān)腹縫合。48h后留取小鼠的全血、腹腔灌洗液、脾臟、肺泡灌洗液、肺組織等標(biāo)本。分別用比色法和考馬斯亮藍(lán)法測定肺灌洗液中白蛋白和總蛋白含量，二者相比計(jì)算肺通透指數(shù)(LPI)，觀察小鼠有無急性肺損傷發(fā)生，并測定肺組織中Nrf2的表

3、達(dá)水平。檢測小鼠腹腔灌洗液和血清中鐵離子、轉(zhuǎn)鐵蛋白、鐵蛋白的表達(dá)水平。檢測小鼠外周血及腹腔灌洗液中T淋巴細(xì)胞數(shù)目;RT-PCR檢測各組小鼠T淋巴細(xì)胞中caspase3、caspase4、caspase8、caspase9、caspase12、Bcl-1、Bax、CHOP mRNA的表達(dá)情況;測定各組小鼠T淋巴細(xì)胞中ROS、GSH含量;RT-PCR和Western blot法檢測各組小鼠T淋巴細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)情況并對比分析;流式細(xì)胞儀

4、測定各T淋巴細(xì)胞亞群凋亡比例。
　　結(jié)果:
　　(1)根據(jù)各亞組小鼠的生存情況用SPSS軟件進(jìn)行生存分析，結(jié)果可見小鼠死亡率隨著膿毒癥加重而明顯增加。
　　(2)測定肺通透指數(shù)(LPI)，結(jié)果示輕度膿毒癥組肺通透指數(shù)與假手術(shù)組相比無顯著差異，但重度膿毒癥時(shí)肺通透指數(shù)升高，出現(xiàn)急性肺損傷。說明膿毒癥模型構(gòu)建成功。
　　(3)測定肺組織中Nrf2的表達(dá)水平:
　　WB檢測肺組織中Nrf2蛋白及其磷酸化水平表達(dá)情

5、況，結(jié)果示輕度膿毒癥組中的表達(dá)量較假手術(shù)組略有降低，而重度膿毒癥組中的表達(dá)量較假手術(shù)組明顯升高。磷酸化的Nrf2在各動物間表達(dá)差異較大，但重度膿毒癥組中的表達(dá)量較假手術(shù)組還是有所升高。
　　RT-PCR檢測Nrf2在mRNA水平表達(dá)情況，結(jié)果示Nrf2的mRNA表達(dá)水平在輕度膿毒癥組小鼠中略有升高，且在重度膿毒癥組小鼠中顯著升高。
　　(4)檢測小鼠腹腔灌洗液中鐵離子、轉(zhuǎn)鐵蛋白、鐵蛋白含量，結(jié)果顯示:重度膿毒癥組小鼠腹腔灌洗

6、液中的鐵離子、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白含量較假手術(shù)組均有所升高。
　　(5)檢測小鼠血清中鐵離子、轉(zhuǎn)鐵蛋白、鐵蛋白含量，結(jié)果顯示:重度膿毒癥組小鼠血清中鐵離子的含量較假手術(shù)組顯著降低，而血清中鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量較假手術(shù)組均有顯著升高。
　　(6)檢測CLP建模后小鼠脾臟中各T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)目變化，結(jié)果顯示:重度膿毒癥組小鼠脾臟中CD3、CD4、CD8的陽性率較假手術(shù)組均有顯著下降。
　　(7)驗(yàn)證T淋巴細(xì)胞死亡是否為鐵死亡

7、:
　　RT-PCR檢測各組小鼠T淋巴細(xì)胞中caspase3、caspase4、caspase8、caspase9、caspase12、Bcl-1、Bax、CHOP mRNA的表達(dá)，結(jié)果可見各基因在輕度膿毒癥組中的表達(dá)均略有升高，而在重度膿毒癥組中除caspase12外，其余各基因的表達(dá)均與假手術(shù)組和輕度膿毒癥組相比升高顯著，caspase12雖也有升高，但各組間差異較大。
　　輕度膿毒癥組小鼠T淋巴細(xì)胞中的ROS含量較假手

8、術(shù)組略有升高，重度膿毒癥組小鼠T淋巴細(xì)胞中的ROS含量較假手術(shù)組顯著升高。輕度膿毒癥組和重度膿毒癥組小鼠T淋巴細(xì)胞中的GSH含量較假手術(shù)組均顯著降低。
　　Western blot檢測各組小鼠T淋巴細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)情況時(shí)，Nrf2和p-Nrf2無法得到合適條帶。RT-PCR檢測結(jié)果示:輕度膿毒癥組小鼠T淋巴細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)量較假手術(shù)組略有升高，重度膿毒癥組小鼠Nrf2表達(dá)量較假手術(shù)組顯著升高。
　　用流式細(xì)胞術(shù)檢測各