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文檔簡介
1、第一部分肝源性hepcidin基因沉默小鼠模型的建立
研究目的:陽離子抗菌肽hepcidin是一種主要由肝臟合成分泌的小分子多肽。除了具有微弱的殺菌作用外,hepcidin亦是機(jī)體唯一的鐵調(diào)素,主要參與鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。研究表明,膿毒癥病人血清和尿液hepcidin的水平較對(duì)照組明顯升高。因而推測hepcidin可能在膿毒癥的感染和免疫炎癥調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。因此,本部分研究擬采用尾靜脈高動(dòng)力大劑量注射hepcidin特異性干
2、擾腺病毒的方法構(gòu)建肝源性hepcidin基因沉默小鼠模型,為進(jìn)一步分析肝源性hepcidin在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。
研究方法:采用尾靜脈高動(dòng)力大劑量注射的方法,給予balb/c雄性小鼠注射針對(duì)小鼠hepcidin基因(hepc1)的特異性shRNA重組腺病毒載體(Ad-shHepc1),對(duì)肝臟hepcidin進(jìn)行基因沉默。對(duì)照組采用同樣的方法給予對(duì)照重組腺病毒(Ad-shNeg)。于注射后13天,取小鼠的外周血、肝
3、、脾、肺和腎臟等進(jìn)行檢測。采用定量PCR方法檢測外周血白細(xì)胞、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織hepcidin的mRNA表達(dá)水平。采用免疫組織化學(xué)的方法檢測肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織hepcidin的蛋白表達(dá)水平。采用普魯士藍(lán)染色的方法檢測脾臟鐵含量。同時(shí),采用原子吸收光譜法測定小鼠血清濃度,酸消化法檢測脾臟和肝臟組織的非血紅素鐵含量。
結(jié)果:與注射對(duì)照重組腺病毒(Ad-shNeg)的小鼠相比較,尾靜脈高動(dòng)力大劑量注射hepcidi
4、n特異性shRNA重組腺病毒載體(Ad-shHepc1)的小鼠13天后,肝臟hepcidin的mRNA水平和蛋白水平明顯降低。其他組織臟器如白細(xì)胞、脾臟、肺臟和腎臟,hepcidin表達(dá)水平無明顯變化。注射Ad-shHepc1的小鼠,脾臟巨噬細(xì)胞鐵含量較對(duì)照組明顯降低,血清鐵含量較對(duì)照組明顯升高。然而,兩組肝臟鐵含量無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
結(jié)論:尾靜脈高動(dòng)力大劑量注射hepcidin特異性shRNA重組腺病毒載體(Ad-shHep
5、c1),能夠有效抑制肝臟hepcidin表達(dá),降低脾臟鐵含量,增加血清鐵水平,成功構(gòu)建了肝源性hepcidin基因沉默(hepcidin knockdown)小鼠模型。
第二部分肝源性hepcidin對(duì)膿毒癥發(fā)生發(fā)展的影響
研究目的:Hepcidin是一種主要由肝臟合成分泌的,β-defensin樣的陽離子抗菌肽,具有廣泛的生物學(xué)活性。大量研究表明,炎癥等刺激能夠誘導(dǎo)肝源性hepcidin的表達(dá)上調(diào)。前期研究顯示,危
6、重病患者血漿IL-6的水平與hepcidin的含量密切相關(guān)。臨床研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥病人血清和尿液hepcidin的水平明顯升高。鑒于肝源性Hepcidin knockdown小鼠模型的成功建立,因此本部分研究主要探討肝源性hepcidin對(duì)膿毒癥發(fā)生發(fā)展的影響。
研究方法:采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)對(duì)肝源性hepcidin knockdown(Ad-shHepc1)小鼠和對(duì)照組(Ad-shNeg)小鼠進(jìn)行膿毒癥模型的復(fù)制,觀察
7、兩組小鼠膿毒癥的7天生存率。同時(shí),于CLP手術(shù)后24小時(shí)收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的組織樣本,如外周血、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等。采用定量PCR和免疫組化法檢測小鼠膿毒癥后肝臟hepcidin的表達(dá)變化。采用蘇木素-伊紅(HE)染色的方法檢測肝臟和肺臟的組織病理變化。采用血清AST和ALT檢測的方法評(píng)估肝功能的變化。采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)染色的方法檢測脾臟組織的凋亡損傷情況。采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測外周血炎癥因子
8、IL-6和TNF-a的水平變化。采用瓊脂平板培養(yǎng)法檢測小鼠外周血和器官臟器的細(xì)菌感染情況。
結(jié)果:給予CLP膿毒癥手術(shù)后,肝源性hepcidin knockdown小鼠7天生存率較對(duì)照組明顯降低。CLP手術(shù)24小時(shí)后,與對(duì)照組相比較,肝源性hepcidinknockdown小鼠肝臟hepcidin的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低。同時(shí),肝源性hepcidin knockdown小鼠膿毒癥后肝臟損傷明顯加重,血清ALT和AST
9、水平明顯升高。肺組織損傷嚴(yán)重,肺損傷評(píng)分明顯增高。脾臟凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯增多。肝臟組織的NADPH氧化酶活性亦明顯增強(qiáng),氧化應(yīng)激損傷加重。此外,膿毒癥打擊后,肝源性hepcidin knockdown小鼠血漿炎癥因子水平較對(duì)照組明顯降低,外周血及肝臟和肺臟的細(xì)菌負(fù)荷較對(duì)照組明顯增多,而兩組小鼠脾臟的細(xì)菌數(shù)量無明顯差異。
結(jié)論:肝源性hepcidin knockdown小鼠膿毒癥的死亡率明顯增加。給予膿毒癥打擊后,肝源性hepc
10、idin knockdown小鼠臟器損傷、氧化應(yīng)激和細(xì)菌感染程度均明顯加重,免疫反應(yīng)能力亦明顯減弱。肝源性hepcidin在膿毒癥感染的免疫防御和預(yù)后中可能發(fā)揮重要作用。
第三部分肝源性hepcidin影響膿毒癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究
研究目的:肝源性hepcidin參與機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。感染和炎癥等刺激能夠誘導(dǎo)hepcidin的表達(dá)上調(diào)。hepcidin在感染和炎癥免疫中可能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。鑒于肝源性hepcid
11、in knockdown小鼠膿毒癥的7天生存率明顯降低,因此,本部分研究主要探討肝源性hepcidin影響膿毒癥發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。
研究方法:采用盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)對(duì)肝源性hepcidin knockdown小鼠及對(duì)照組小鼠進(jìn)行膿毒癥模型的復(fù)制,觀察術(shù)后24小時(shí)小鼠鐵代謝變化。采用原子吸收光譜法檢測血清鐵水平。采用普魯士藍(lán)染色和酸消化法檢測脾臟組織鐵含量。同時(shí),給予小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系以不同濃度的鐵螯合劑去鐵胺(
12、deferoxamine,DFO)處理,通過吞噬熒光顆粒的方法采用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)觀察巨噬細(xì)胞的吞噬能力,通過脂多糖(LPS)的刺激采用熒光定量PCR的方法檢測巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)能力。最后,對(duì)肝源性hepcidin knockdown小鼠給予低鐵飲食聯(lián)合腹腔注射去鐵胺的方法處理,13天后檢測肝源性hepcidinknockdown小鼠血清鐵含量的水平。并且給予低鐵處理組小鼠和未給予低鐵處理組小鼠以膿毒癥的打擊,觀察兩組膿毒癥小鼠的
13、7天生存率。
結(jié)果:膿毒癥手術(shù)24小時(shí)后,與對(duì)照組小鼠相比較,肝源性hepcidin knockdown小鼠血清鐵含量明顯升高,脾臟巨噬細(xì)胞的鐵含量明顯減少。同時(shí),經(jīng)鐵螯合劑處理后的RAW264.7吞噬細(xì)胞,其細(xì)胞胞內(nèi)吞噬熒光顆粒的數(shù)量及熒光顆粒的強(qiáng)度較未處理細(xì)胞均明顯降低,其對(duì)脂多糖(LPS)刺激后的炎癥反應(yīng)能力亦明顯減弱,巨噬細(xì)胞炎癥因子IL-6的mRNA水平較未處理細(xì)胞明顯降低。此外,給予低鐵飲食聯(lián)合腹腔注射去鐵胺的方法
14、處理肝源性hepcidin knockdown小鼠后,肝源性hepcidin knockdown小鼠血清高鐵負(fù)荷狀態(tài)明顯改善。給予膿毒癥打擊后,低鐵處理后的肝源性hepcidin knockdown小鼠膿毒癥的7天生存率亦明顯改善。
結(jié)論:肝源性hepcidin knockdown小鼠膿毒癥后鐵代謝紊亂,表現(xiàn)為血清鐵水平明顯升高,脾臟巨噬細(xì)胞鐵含量明顯減少。胞內(nèi)鐵含量減少明顯抑制巨噬細(xì)胞的吞噬功能和炎癥反應(yīng)能力。低鐵處理肝源性
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