NGAL在膿毒癥性急性腎損傷時的作用及腎臟保護性機制研究.pdf

1、急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)，既往被稱為急性腎衰竭，是指腎功能突然下降，但病程在3個月以內(nèi)的一組臨床綜合癥。研究顯示，在危重癥病人中AKI的發(fā)病率可達30-50%，而由膿毒癥引發(fā)的AKI(sepsis-induced AKI or septic AKI)約占AKI總發(fā)病率的50%。Septic AKI病人具有更緊急的入院情況、更多的合并癥和更高的危險評分，而且即使我們治療危重癥的方法和支持手段在不斷進步，

2、septic AKI病人的死亡率仍然高達60%。
　　Septic AKI病人的不良預后有著很多原因，首先是我們對septic AKI的病理生理機制尚不完全清楚，局限了我們對治療方法的改進；此外在臨床工作中，血清肌酐(serum creatine，SCr)仍然是診斷和治療AKI的檢測指標，但它會受到肌肉質(zhì)量、血壓和飲食中蛋白質(zhì)攝入量等諸多因素的影響，且與腎臟細胞的急性損傷間無明確的相關(guān)性。因此SCr并不是能夠及時而準確的反應AKI

3、的生物學標志物，不能使我們在AKI的初期就能做出診斷并及時的逆轉(zhuǎn)腎細胞的損傷，我們需要尋找新的AKI的生物學標志物。
　　在目前已確認的AKI的生物學標志物中，中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)被認為是最為重要和理想的標志物。眾多研究在造影劑相關(guān)性腎病和缺血/再灌性AKI(心臟術(shù)后AKI和腎移植術(shù)后AKI)病人中對NGAL的臨床診斷價值

4、進行了評價。顯示NGAL是AKI良好的診斷標志物，其敏感性為0.815。近幾年來，也有幾項研究評價了NGAL對兒科或成人危重病病人septicAKI的診斷和預測價值。然而，NGAL作為septic AKI診斷標志物時出現(xiàn)了一些難以解釋的問題，無論血清中的NGAL(serum NGAL，sNGAL)還是血漿中的NGAL(plasma NGAL，pNGAL)雖然具有很高的診斷敏感性，但是診斷的特異性卻很低。而尿液中的NGAL(urinary

5、 NGAL，uNGAL)顯示了更好的診斷特異性，只在膿毒癥合并AKI的病人中升高，在未合并AKI的病人中并不升高。體液中NGAL在診斷AKI時出現(xiàn)的不確定性，為診斷和治療AKI帶來了困擾。因此，我們應該進一步研究septic AKI時腎臟NGAL的變化規(guī)律及與s/pNGAL、uNGAL的關(guān)系，以能正確分析NGAL在臨床檢測AKI時表現(xiàn)出來的差異。
　　目前，對于NGAL和腎組織內(nèi)細胞損傷機制之間關(guān)系的研究還很有限，NGAL作為AK

6、I的生物學標志物，是否能夠及時反應腎組織細胞內(nèi)損傷機制的變化還不明確。對于septic AKI，NGAL與腎組織內(nèi)炎癥反應的關(guān)系應是首要的研究課題。此外，NGAL作為腎臟上皮細胞在膿毒癥時表達增多的一個急性期蛋白，它在受損上皮細胞中的作用尚不明確，也值得進一步探討。
　　基于以往的研究資料，本研究通過制備和觀察內(nèi)毒素(lipopolysaccharides，LPS)損傷所致的septic AKI大鼠模型，及應用LPS刺激的人腎近端

7、小管上皮細胞系(HK-2)，從在體水平及細胞水平明確NGAL mRNA的表達規(guī)律，并進一步觀察了NGAL mRNA與pNGAL、uNGAL、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNFα)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、細胞凋亡間的關(guān)系，為將NGAL更好的應用于臨床septic AKI病人的診斷、治療中提供了切實的理論依據(jù)。
　　1內(nèi)毒素致大鼠膿毒癥性急性腎損傷模型的制備
　　目的

8、：采用適當劑量的LPS腹腔內(nèi)注射致大鼠發(fā)生AKI，通過觀察血肌酐水平和腎組織病理改變以明確腎損傷，為以后的實驗研究提供科學而穩(wěn)定的動物模型。
　　方法：按照處理因素和時間的不同將大鼠分為6組，每組6只。對照組(Con)為鹽水處理組，給予0.9%鹽水(1ml)腹腔內(nèi)注射；其余5組為LPS處理組，給予大鼠腹腔內(nèi)注射LPS(3.5mg/kg)，分別處理1、3、6、12、24h，并按照處理時間設(shè)定為：LPS1h組、LPS3h組、LPS6h

9、組、LPS12h組、LPS24h組。實驗各組按照預設(shè)時間點，采集血液標本以測定血肌酐水平，留取腎臟標本行光鏡及電鏡下病理組織學觀察以明確腎損傷。
　　結(jié)果：①SCr在LPS處理后3-12h升高，LPS3h、LPS6h、LPS12h組與Con組相比有顯著差異(P<0.01)；②光鏡下腎組織病理學檢查可見損傷以腎皮質(zhì)中的腎小管上皮細胞最為顯著，表現(xiàn)為細胞水腫，官腔變小。細胞損傷以LPS處理后3-12h最為嚴重；透射電子顯微鏡觀察到腎近

10、端小管上皮細胞微絨毛紊亂、受損，細胞內(nèi)水腫，線粒體外膜受損等損傷的表現(xiàn)，還可見核膜固縮、染色質(zhì)邊集的凋亡細胞。
　　小結(jié)：大鼠腹腔內(nèi)注射LPS可以誘導出現(xiàn)septic AKI，septic AKI發(fā)生時以腎小管上皮細胞的病理損傷為主，并可見細胞凋亡。這一動物模型為下一步觀察腎損傷標志物-NGAL提供了實驗基礎(chǔ)。
　　2膿毒癥性急性腎損傷腎組織內(nèi)NGAL的表達變化及意義
　　目的：NGAL雖然能夠作為septic AKI

11、的較為理想的生物學標志物，但是腎損傷時腎組織內(nèi)NGAL的表達變化與體液中NGAL水平及腎組織內(nèi)炎癥反應的關(guān)系尚不明確。此次研究目的是在前期制備的septic AKI大鼠模型的基礎(chǔ)上，進一步明確NGAL mRNA在腎組織中的變化規(guī)律和表達部位，腎組織內(nèi)NGAL mRNA與TNFα mRNA、IL-6 mRNA的相關(guān)性及與sNGAL、uNGAL的關(guān)系。
　　方法：動物分組和處理同第一部分。實驗各組按照預設(shè)時間點采集標本。采集血液及尿液

12、標本以ELESA方法測定NGAL水平，留取腎臟標本應用原位雜交技術(shù)確認NGAL mRNA的表達部位及表達強度，并應用qRT-PCR方法檢測LPS處理后腎組織中NGAL mRNA與TNFαmRNA、IL-6 mRNA的表達水平。
　　結(jié)果：①應用原位雜交技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Con組大鼠的腎臟中NGALmRNA只在遠曲小管上皮細胞和髓質(zhì)的集合管細胞中有微弱的表達，近曲小管細胞完全不表達。而在LPS1h、LPS3h、LPS6h、LPS12h各組，

13、即在LPS處理后1-12h，septic AKI大鼠腎組織中NGAL mRNA的表達明顯增強，34.3%-49.6%的腎皮質(zhì)內(nèi)的小管上皮細胞為NGAL mRNA+，并觀察到腎近端小管上皮細胞也同時表達NGAL mRNA。在LPS處理后LPS24h組，大鼠的腎組織中NGAL mRNA的表達明顯減弱。②腎組織中TNFα mRNA、IL-6 mRNA的表達在LPS處理后即刻升高。TNFα，mRNA在LPS1h組即達高峰，為Con組的24.18

14、±6.39倍，與Con組相比差異顯著(P<0.01)，而后TNFα，mRNA下降，在LPS處理3h后，各組TNFα，mRNA與Con組相比無差異(P>0.05)；IL-6 mRNA在1-3h顯著升高，LPS1h、LPS3h組與Con組相比差異顯著(P<0.01)，其在LPS3h組達高峰，為Con組的68.40±11.04倍。IL-6 mRNA在LPS處理6h后下降至正常水平，與Con組相比無顯著差異(P>0.05)；NGALmRNA在L

15、PS1h、LPS24h組與Con組比較無顯著差別(P>0.05)，但在LPS3h、LPS6h、LPS12h各組，即LPS處理后3-12h，表達顯著上調(diào)，與Con組相比差異顯著(P<0.01)，其峰值水平出現(xiàn)在LPS6h組，為Con組的226.71±37.22倍；雖然NGAL mRNA在腎組織內(nèi)表達上調(diào)和下降均滯后于炎性因子，但TNFα mRNA與NGAL mRNA之間顯示了良好的相關(guān)性，(r=0.995，P<0.001)，而IL-6 m

16、RNA與NGAL mRNA間不相關(guān)(r=0.276，P=0.653)。③pNGAL與uNGAL在LPS處理后即刻升高。pNGAL在1-24h均維持升高水平，LPS1h、LPS3h、LPS6h、LPS12h及LPS24h組與Con組相比均差異顯著(P<0.01)；因LPS1h組大鼠無尿，uNGAL顯示從LPS3h組顯著升高，并在LPS3h、LPS6h、LPS12h各組，即LPS處理后3-12h，維持升高水平，與對照組相比差異顯著(P<0.

17、01)，uNGAL在LPS24h組回降到Con組水平(P>0.05)；pNGAL峰值水平為192.68±14.37ng/ml，出現(xiàn)在LPS3h組，而uNGAL峰值水平為154.42±12.75ng/ml，出現(xiàn)在LPS6h組；uNGAL水平與腎組織內(nèi)NGAL mRNA水平密切相關(guān)(r=0.850，P<0.001)；但pNGAL水平與腎組織內(nèi)NGAL mRNA水平無相關(guān)性(r=0.328，P>0.05)。
　　小結(jié)：當septic A

18、KI發(fā)生時，受損的腎小管上皮細胞顯著上調(diào)表達NGAL mRNA，上調(diào)水平與腎組織內(nèi)的核心炎癥因子.TNFα的上調(diào)水平密切相關(guān)；uNGAL水平與腎組織內(nèi)NGAL mRNA的變化密切相關(guān)，真實的反映了腎損傷狀態(tài)；而pNGAL水平與腎組織內(nèi)NGAL mRNA的變化不相關(guān)，提示pNGAL并不是septic AKI的良好標志物。這一研究結(jié)果為能更好的應用NGAL診斷septic AKI提供了新的理論依據(jù)。
　　3內(nèi)毒素誘導腎小管HK-2細胞

19、中NGAL的表達及抗凋亡機制的研究
　　目的：在本課題的前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞即是septicAKI時損傷的主要部位，也是NGAL的主要表達部位，而NGAL與細胞損傷機制間的確切關(guān)系尚不明確。因此，此次研究的目的是應用LPS刺激人腎臟近端小管上皮細胞(HK-2)，觀察NGAL mRNA和caspase3mRNA的表達變化及二者間的相關(guān)性。并應用siRNA沉默HK-2細胞中的NGAL基因，以觀察NGAL對caspase3

20、 mRNA及細胞凋亡水平的影響，從而明確在septic AKI時，受損的腎臟上皮細胞中NGAL的保護作用及機制。
　　方法：①將HK-2細胞以5×105個/ml的密度接種于6孔板內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)24h后分為6組，為Con組和LPS處理組。LPS處理組分為5組，更換含有LPS50uM的單純培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)1、3、6、12、24h，并按照培養(yǎng)時間設(shè)定為：LPS1h組、LPS3h組、LPS6h組、LPS12h組、LPS24h組。以上各組到達

21、預設(shè)時間點后，將細胞收集，以qRT-PCR方法檢測NGAL mRNA、Caspase3 mRNA的表達水平；②將HK-2細胞以2×105個/ml的密度接種于6孔板內(nèi)，應用只含有10%胎牛血清，而無抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。而后將細胞孔板分為Con、LPS、siRNA3、siRNA3+LPS共4組。其中Con、LPS組只更換單純培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，而siRNA3、siRNA3+LPS組加入含有轉(zhuǎn)染試劑(NGAL siRNA3)的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染3

22、6h，并于熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果；而后Con和siRNA3組更換單純的培養(yǎng)基，LPS和siRNA3+LPS組更換含有LPS50uM的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3h。以上各組到達預設(shè)時間點后，將細胞收集，以qRT-PCR方法檢測NGAL mRNA、Caspase3 mRNA的表達水平；③按照方法②中的方式培養(yǎng)及處理HK-2細胞后，以流式細胞儀及TUNEL法檢測各組HK-2細胞的凋亡情況。
　　結(jié)果：①LPS50uM刺激HK-2細胞后，N

23、GAL mRNA在LPS1h、LPS3h、LPS6h組，即LPS處理后1-6h內(nèi)顯著升高(LPS1h組和LPS3h組，P<0.001；LPS6h組，P<0.01)，在LPS處理12h后NGALmRNA恢復到基線水平，LPS12h、LPS24h組與Con組相比無顯著差異(P>0.05)。Caspase3 mRNA在LPS1h、LPS3h組，即LPS處理后的1-3h內(nèi)顯著升高(LPS1h組，P<0.001；LPS3h組，P<0.05)，在L

24、PS處理6h后Caspase3 mRNA恢復到基線水平，LPS6h、LPS12h、LPS24h各組與Con組相比無顯著差異(P>0.05)；經(jīng)相關(guān)性分析，NGAL mRNA與Caspase3 mRNA間存在良好的相關(guān)性(r=0.448，P<0.05)。②LPS組NGAL mRNA表達水平顯著升高(P<0.001)，為Con組的3.177±0.239倍，而Caspase3 mRNA亦顯著上調(diào)(P<0.01)，為Con組的2.361±0.2

25、87倍；siRNA組NGAL mRNA表達水平顯著受到抑制(P<0.01)，只為Con組的28.5%，而Caspase3 mRNA無顯著變化，與對照組相比無顯著差異(P>0.05)；siRNA+LPS組NGAL mRNA表達水平也顯著受到抑制(P<0.01)，但較siRNA組的表達水平略有升高，為對照組的46.6%，但Caspase3mRNA顯著升高(P<0.001)，為Con組的4.556±0.278倍，并且與siRNA組、LPS組相

26、比也均有顯著差異(P<0.001)。③經(jīng)流式細胞儀檢測，Con組具有1.08%的壞死率，具有10.55%的凋亡率；siRNA組壞死率為1.25%，凋亡率為13.71%，與Con組相比均無顯著差異(P>0.05)；LPS組壞死率為2.38%，凋亡率為21.53%，與Con組及siRNA組相比均具有顯著差異(P<0.001)；siRNA+LPS組壞死率為2.34%，凋亡率為36.06%，該組的壞死率與Con組及siRNA組相比具有顯著差異(

27、P<0.001)，與LPS組相比無顯著差異(P>0.05)，該組的凋亡率與其他三組相比均具有顯著差異(P<0.001)。④TUNEL檢測HK-2細胞凋亡的結(jié)果可見：Con組及siRNA組少見陽性凋亡細胞，LPS組陽性凋亡細胞數(shù)較多，siRNA+LPS組陽性凋亡細胞數(shù)最多。
　　小結(jié)：本研究中顯示在LPS介導的HK-2細胞損傷中，細胞凋亡是其主要的病理特征；NGAL基因在受損的腎臟小管上皮細胞中能夠及時上調(diào)表達，并能夠抑制Caspa

28、se3基因的上調(diào)，從而抑制了細胞的凋亡，減輕了細胞損傷。這一研究結(jié)果為更好的診斷和治療septic AKI提供了新的思路和靶點。
　　結(jié)論：
　?、儆蒐PS可以誘導大鼠出現(xiàn)septic AKI，病理組織學變化以腎小管上皮細胞水腫、微絨毛紊亂為主要表現(xiàn)，并可見細胞凋亡；
　?、诋攕eptic AKI發(fā)生時，受損的腎小管上皮細胞顯著上調(diào)表達NGAL mRNA，上調(diào)水平與腎組織內(nèi)的核心炎癥因子TNFα的上調(diào)水平密切相關(guān)；uN

29、GAL水平與腎組織內(nèi)NGAL mRNA的變化密切相關(guān)，真實的反映了腎損傷狀態(tài)；而pNGAL并不是septic AKI的良好標志物。這一研究結(jié)果為能更好的應用NGAL診斷septic AKI提供了新的理論依據(jù)；
　?、墼贚PS介導的腎小管上皮細胞損傷中，細胞凋亡是其主要的病理特征；NGAL mRNA在受損的上皮細胞中能夠及時上調(diào)表達，并對Caspase3 mRNA的上調(diào)有顯著的抑制作用，從而能夠抑制細胞的凋亡，減輕了細胞損傷。這一研