糖胺聚糖在膿毒癥中內(nèi)皮糖萼保護(hù)作用的研究.pdf

1、膿毒癥又稱全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，是重癥監(jiān)護(hù)室中位居第一的致死病癥。膿毒癥發(fā)病原因多為嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、器官移植或大手術(shù)之后帶來的細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等病原微生物所引起的感染，并進(jìn)一步發(fā)展成為系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)、免疫失控和凝血功能障礙。炎癥反應(yīng)、免疫失控和凝血功能障礙三者相互作用又可導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunc

2、tion syndrome，MODS)，最終導(dǎo)致患者死亡。近年來，膿毒癥發(fā)病有逐年上升趨勢，全球每年大約新增一千九百萬例膿毒癥患者。膿毒癥的死亡率超過四分之一。膿毒癥發(fā)病率高且發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其發(fā)病迅速，病程進(jìn)展快，目前無有效的治療手段，膿毒癥和膿毒性休克已成為重癥醫(yī)學(xué)面臨的首要難題。
　　膿毒癥中內(nèi)皮細(xì)胞糖萼的破壞是病理進(jìn)程中的重要環(huán)節(jié)。血管內(nèi)皮糖萼的結(jié)構(gòu)被破壞之后，其功能缺失。首先，血管內(nèi)皮糖萼的屏障功能削弱或喪失，隱藏在其中的

3、多種信號分子和酶也同時喪失;其次，血管內(nèi)皮糖萼對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用遭到破壞，糖萼的機(jī)械應(yīng)力轉(zhuǎn)導(dǎo)功能被削弱。之后，一系列病理改變出現(xiàn)，包括血管通透性增加，水腫的發(fā)生，內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞的粘附，凝血系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的失衡與血管緊張度降低等。
　　肝素(Heparin，HP)和低分子肝素應(yīng)用于膿毒癥的治療已有多年臨床實踐經(jīng)驗，主要是發(fā)揮抗凝作用。鑒于糖胺聚糖是內(nèi)皮糖萼的主要成分，膿毒癥時外源糖胺聚糖對膿毒癥時損傷糖萼的保護(hù)作用尚無系統(tǒng)的研

4、究。本課題擬考察肝素及其衍生物以及舒洛地特(Sulodexide，SLX)對膿毒癥中糖萼破壞因素以及糖萼破壞情況的影響，及其對心臟、小腸和腦部糖萼損傷的保護(hù)作用，以闡明糖胺聚糖類藥物在膿毒癥中的治療作用及其機(jī)制。主要研究內(nèi)容包括:
　　1.建立小鼠膿毒癥生存率模型，考察HP及其衍生物(包括SST0001，M402，ROH)，乙酰肝素，SLX對小鼠膿毒癥28天生存率的影響。其中ROH，HP，SLX可顯著提高膿毒癥小鼠的生存率。選擇這

5、三者開展后續(xù)研究。
　　2.建立小鼠膿毒癥模型，用ELISA法檢測HP、ROH和SLX對膿毒癥小鼠血清HPA和MMP-9這兩個糖萼破壞因素、HS和Syndecan-1這兩種糖萼脫落標(biāo)志物的含量及其時相變化的影響。
　　2.1 膿毒癥時小鼠血清HPA含量變化以及三種糖胺聚糖對此影響。
　　膿毒癥模型組小鼠HPA血清含量在造模后3～12h與對照組相比顯著下降(P＜0.05)，且3h～12h時間段內(nèi)小鼠HPA血清含量持續(xù)下降

6、(P＜0.05)。HP組在造模后3h，9h，12h顯著低于膿毒癥模型組(P＜0.05)，造模后6h與膿毒癥模型組差異不顯著(P＞0.05);ROH組在造模后3h，6，h12h明顯低于膿毒癥模型組(P＜0.05)，在造模后9h與膿毒癥模型組差異不顯著(P＞0.05);SLX組在造模后3h，6h，9h，12h與膿毒癥模型組差異不顯著(P＜0.05)。這一反常結(jié)果經(jīng)多次重復(fù)實驗確認(rèn)，原因有待闡明。
　　2.2 膿毒癥時小鼠血清MMP-9

7、含量變化以及三種糖胺聚糖對此影響。
　　膿毒癥小鼠血清MMP-9的含量在造模后3小時顯著上升(P＜0.05)，6小時達(dá)峰值，繼而回落，在造模后9h和12h與對照組無顯著差異(P＞0.05)。在造模后3h, HP組和ROH組與模型組相比顯著下降(P＜0.05)，SLX組無顯著性差異(P＞0.05);造模6h后，HP組、ROH組和SLX組與模型組相比顯著下降(P＜0.05)。這表明HP、ROH和SLX可以顯著抑制膿毒癥中MMP-9的表

8、達(dá)。
　　2.3 膿毒癥時小鼠血清HS含量變化以及三種糖胺聚糖對此影響。
　　膿毒癥小鼠血清HS含量在造模后3h～12h的時間段內(nèi)與對照組相比顯著上升(P＜0.05)，說明糖萼損傷已經(jīng)發(fā)生。HP、ROH和SLX組在造模后3h～12h時間段內(nèi)小鼠血清HS含量與模型組相比，顯著下降(P＜0.05)，但仍舊高于正常組。HS是由HPA水解糖萼產(chǎn)生，雖然在造模后3h～12h，膿毒癥模型組小鼠血清HPA含量始終低于正常對照組，但從后續(xù)實

9、驗免疫組化的結(jié)果來看，膿毒癥模型組小鼠在心臟、小腸、腦組織水平表達(dá)比正常對照組明顯上升，說明組織中的HPA可以起到破壞糖萼的作用，因此在血清中可以檢測到糖萼脫落標(biāo)志物HS的含量上升。
　　2.4 膿毒癥時小鼠血清Syndecan-1含量變化以及三種糖胺聚糖對此影響。
　　膿毒癥模型組小鼠血清Syndecan-1含量在造模3h～12h的時間段內(nèi)與對照組相比顯著上升(P＜0.05)，說明糖萼損傷已經(jīng)發(fā)生，具體表現(xiàn)為在造模后3～9

10、h持續(xù)上升，9h達(dá)峰值，繼而下降，12h仍高于正常對照組，(P＜0.05)。HP組在3h、6h與模型組相比無顯著性差異(P＞0.05);9h與模型組相比，顯著下降(P＜0.05)，12h無顯著性差異(P＞0.05)。ROH組在3h明顯高于模型組(P＜0.05)，6h與模型組相比無顯著性差異(P＞0.05)，9h、12h與模型組相比無顯著性差異(P＞0.05)。SLX組在3h、6h明顯高于模型組(P＜0.05)，在9h、12h與模型組相比

11、無顯著性差異(P＞0.05)。
　　3.三種糖胺聚糖對膿毒癥小鼠心臟組織的保護(hù)作用。
　　HE染色結(jié)果顯示，膿毒癥模型小鼠室壁局部心外膜下心肌細(xì)胞壞死、鈣化，HP、SLX、ROH干預(yù)后，上述病理改變減輕。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠心臟主動脈內(nèi)皮細(xì)胞糖萼破壞明顯;HP、SLX、ROH干預(yù)后，心臟主動脈內(nèi)皮細(xì)胞糖萼損傷有不同程度的減輕。三者對膿毒癥小鼠心臟組織保護(hù)作用的強(qiáng)弱關(guān)系為:SLX＞HP＞ROH。免疫組化結(jié)果表明，膿毒癥小

12、鼠心臟組織中HPA，MMP-9的表達(dá)與對照組相比表達(dá)明顯增多，而HP、SLX、ROH對這兩種酶蛋白在心臟組織中的表達(dá)有抑制作用。
　　4.糖胺聚糖對膿毒癥小鼠小腸組織的保護(hù)作用。
　　HE染色結(jié)果顯示，膿毒癥模型組小鼠小腸大量腸絨毛脫落，粘膜固有層血管擴(kuò)張、充血，局部大范圍腸粘膜全層壞死，HP、SLX、ROH干預(yù)之后，上述病理改變減輕。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠小腸血管內(nèi)皮細(xì)胞糖萼破壞明顯;HP、SLX、ROH干預(yù)之后，小腸

13、血管內(nèi)皮細(xì)胞糖萼損傷有不同程度得減輕。三者對膿毒癥小鼠小腸組織保護(hù)作用的強(qiáng)弱關(guān)系為SLX＞ROH＞HP。免疫組化結(jié)果表明，膿毒癥小鼠小腸中HPA，MMP-9的表達(dá)與對照組相比表達(dá)明顯增多，而HP、SLX、ROH對兩種酶蛋白在小腸中的表達(dá)有抑制作用。
　　5.糖胺聚糖對膿毒癥小鼠大腦組織的保護(hù)作用。
　　HE染色結(jié)果顯示，膿毒癥模型組小鼠大腦皮層區(qū)域與對照組相比無明顯病理學(xué)改變，而海馬區(qū)神經(jīng)元腫脹，部分神經(jīng)元壞死。HP、SLX

14、、ROH干預(yù)后，海馬區(qū)上述病理改變減輕。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠大腦皮層內(nèi)皮細(xì)胞糖萼破壞明顯;HP、SLX、ROH干預(yù)之后，大腦皮層內(nèi)皮細(xì)胞糖萼損傷有不同程度的減輕。三者對膿毒癥小鼠大腦海馬區(qū)保護(hù)效果的強(qiáng)弱關(guān)系為:ROH≈SLX＞HP。免疫組化結(jié)果表明，膿毒癥小鼠大腦皮層和海馬區(qū)HPA，MMP-9的表達(dá)與對照組相比明顯增多，而HP、SLX、ROH對兩種酶蛋白在大腦組織中的表達(dá)有抑制作用。
　　綜上所述，本研究可以得出如下結(jié)論:H

15、P、SLX、ROH可以在膿毒癥時發(fā)揮糖萼保護(hù)作用，降低膿毒癥的死亡率。
　　本課題的創(chuàng)新之處在于:首先，盡管糖胺聚糖在膿毒癥的臨床治療中已經(jīng)積累了不少經(jīng)驗，但對糖萼的保護(hù)作用研究較少。本研究旨在闡明糖胺聚糖藥物治療膿毒癥的機(jī)制，拓寬糖胺聚糖藥物的應(yīng)用范圍，為糖胺聚糖用于膿毒癥的臨床治療提供依據(jù)。其次，采用透射電鏡方法考察了膿毒癥小鼠心臟、小腸和大腦的內(nèi)皮糖萼微觀結(jié)構(gòu)，透射電鏡觀察標(biāo)本固定時未對小鼠做主動脈灌注，避免了糖萼在灌注過程

16、中的脫落。
　　本課題工作有待在以下幾個方面深入:(1)膿毒癥小鼠的血清HPA含量與正常組相比驟然下降，這一反常結(jié)果經(jīng)過多次重復(fù)實驗都是如此，對此需要進(jìn)一步研究以闡明其原因。(2) ROH在膿毒癥小鼠28天生存率中表現(xiàn)出色，尤其是在造模后第二天生存率高達(dá)70％。但在后續(xù)對心臟、小腸和大腦保護(hù)作用的研究中，雖然ROH對內(nèi)皮糖萼保護(hù)作用明顯，卻并沒有始終保持最佳表現(xiàn)，這說明糖萼損傷雖是膿毒癥重要但非唯一的病理機(jī)制，ROH能夠顯著提高生