腎上腺髓質(zhì)素對膿毒癥大鼠小腸微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用研究.pdf

1、目的：腎上腺髓質(zhì)素（Adrenomedulin，ADM）是一種有52個氨基酸殘基組成的活性肽，其除了具有擴張血管，增加管壁通透性等功能外，還有報道腎上腺髓質(zhì)素在對抗炎癥反應(yīng)方面還具有抑制致炎因子釋放，穩(wěn)定血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。因而本實驗欲觀察腎上腺髓質(zhì)素對小腸微血管內(nèi)皮的保護作用是否與降低血管細(xì)胞間黏附分子（Vascular CellAdhesion Molecule-1，VCAM-1）的表達(dá)從而導(dǎo)致炎癥因子的釋放減少有關(guān)，并以該途徑來減

2、緩或抑制膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。
　　 方法：1.大鼠小腸微血管內(nèi)皮細(xì)胞（RIMMVECs）在體外分離運用局部消化方法和差速黏附方法進(jìn)行細(xì)胞的純化處理及培養(yǎng)，并根據(jù)RIMMVECs描繪其生長曲線及用CD34標(biāo)記后免疫熒光鑒定RIMMVECs,然后分別用假手術(shù)組血清，膿毒癥組血清和ADM+膿毒癥組血清刺激24h后進(jìn)行檢測；2. 用RT-PCR 法檢測各組血清刺激后RIMMVECs內(nèi)VCAM-Mrna的轉(zhuǎn)錄水平，觀察ADM在轉(zhuǎn)錄水平對VC

3、AM-1的影響；3.流式細(xì)胞術(shù)檢測各組血清刺激后RIMMVECs 膜表面VCAM-1的表達(dá)，觀察ADM在分子表達(dá)水平對VCAM-1的影響。4.用ELISA 法檢測各組血清刺激RIMMVECs 培養(yǎng)后上清液中可溶性VCAM-1的含量，觀察ADM的輸入是否能減少RIMMVECs內(nèi)VCAM-1的釋放。
　　 結(jié)果：1：局部消化方法和差速黏附方法得到純化的RIMMVECs，純度在90％以上，并用CD34 標(biāo)記后免疫熒光進(jìn)行了鑒定；2：酶

4、聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果顯示ADM 干預(yù)組血清刺激細(xì)胞24h后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VCAM-1的含量(0.21±0.06ng/ml)明顯較膿毒癥組(0.63±0.13ng/ml)的含量低，而ADM 干預(yù)組與正常組(0.09±0.02 ng/ml)無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05)；3：RT-PCR 結(jié)果顯示ADM 干預(yù)組刺激的細(xì)胞內(nèi)VCAM-1mRNA的水平低于膿毒癥組,有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05)，而與正常組比較無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.

5、05)；4：FITC 標(biāo)記抗大鼠VCAM-1單克隆抗體，流式細(xì)胞儀檢測顯示ADM 干預(yù)組刺激的RIMMVECs 膜表面VCAM-1表達(dá)(124.63±54.32)也低于膿毒癥組(202.75±57.21),而與正常組(112.95±47.39)比較無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05)。
　　 結(jié)論：1. ADM能降低膿毒癥血清刺激RIMMVECs后培養(yǎng)上清液中VCAM-1的含量，說明ADM 甚至能減少膿毒癥時RIMMVECs中VC

6、AM-1向體液中的釋放；2. ADM 處理組在細(xì)胞內(nèi)VCAM-1mRNA的表達(dá)水平低于膿毒癥組，說明ADM能抑制VCAM-1在膿毒癥時在內(nèi)皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄；3.ADM能降低膿毒癥血清刺激RIMMVECs后RIMMVECs胞膜上的表達(dá)，說明ADM能減少膿毒癥時VCAM-1在血管內(nèi)皮上的表達(dá)量。因此從分子水平上論證了ADM通過抑制小腸微血管內(nèi)皮細(xì)胞上，炎癥因子釋放上游的調(diào)控黏附分子VCAM-1的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和生成，從而減緩或抑制膿毒癥的發(fā)生發(fā)展