膿毒癥大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的變化及谷氨酰胺對(duì)其保護(hù)作用的研究.pdf

1、研究目的： 本研究通過建立膿毒癥大鼠模型，測(cè)定各組大鼠肺組織含水量、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell，VEC)凋亡的變化、肺VEC細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和E—選擇素蛋白表達(dá)的變化，以及肺組織ICAM-1和E—選擇素mRNA表達(dá)的變化，觀察肺VEC病理形態(tài)學(xué)的變化；探討谷氨酰胺對(duì)膿毒癥大鼠肺VEC的保護(hù)作用及其可能的機(jī)

2、制。 材料與方法： 1、實(shí)驗(yàn)分組 SD大鼠56只，隨機(jī)分成3組：對(duì)照組(18只)、膿毒癥組(18只)和治療組(18只)。用靜脈注射給藥方法，膿毒癥組注射脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)4mg/kg；治療組注射LPS4mg/kg+谷氨酰胺0.3g/kg；對(duì)照組注射生理鹽水。各組動(dòng)物按照觀察時(shí)間點(diǎn)平均分為造模后6h、12h和24h各3個(gè)亞組。 2、模型制作 用0.1％的戊巴比妥

3、鈉4ml/kg作腹腔內(nèi)注射麻醉后，將大鼠于仰臥位固定。于右側(cè)大腿作縱切口找到股靜脈。用靜脈注射給藥方法，注射LPS4mg/kg，制備膿毒癥動(dòng)物模型。 3、檢測(cè)指標(biāo)和方法 在造模后6h、12h和24h時(shí)點(diǎn)處死相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組的大鼠，快速分離左肺組織，測(cè)定其肺組織含水量。快速分離右肺下葉經(jīng)4％多聚甲醛固定12～16h，制成石蠟切片，H．E染色，光學(xué)顯微鏡下觀察標(biāo)本形態(tài)學(xué)變化；進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)肺VEC ICAM-1和E—選擇

4、素蛋白的表達(dá)；進(jìn)行Hoechest33258染色法觀察肺VEC的凋亡。分離右肺中葉，應(yīng)用RT—PCR方法檢測(cè)ICAM-1和E—選擇素mRNA的表達(dá)。分離右肺上葉，組織切塊(約1mm×1mm×2mm)投入2.5％戊二醛固定液固定后，電鏡觀察。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究的數(shù)據(jù)采取SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±S)表示；多組間比較用方差分析；對(duì)于不同處理組的兩兩比較，主要利用了LSD—t法

5、檢驗(yàn)。以p<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、肺組織含水量 在6h和12h時(shí)點(diǎn)各組肺組織含水量無顯著差異(p>0.05)；在24h時(shí)點(diǎn)各組肺組織含水量，膿毒癥組>治療組>對(duì)照組，各組肺組織含水量有顯著差異(p<0.01)。 2、肺VEC凋亡的變化 在6h、12h和24h時(shí)點(diǎn)上，膿毒癥組大鼠肺VEC凋亡多于治療組(p<0.05)和對(duì)照組(p<0.01)；治療組大鼠VEC凋亡多于對(duì)照組(p<

6、0.01)。膿毒癥組和治療組隨著建模時(shí)間的延長(zhǎng)，VEC凋亡逐漸增加；各時(shí)點(diǎn)之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 3、肺VEC ICAM-1蛋白表達(dá)的變化 在6h、12h和24h時(shí)點(diǎn)上，膿毒癥組大鼠肺VEC ICAM-1蛋白的表達(dá)高于治療組(p<0.01)和對(duì)照組(p<0.01)；治療組大鼠肺VEC ICAM-1蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組(p<0.05)。膿毒癥組和治療組隨著建模時(shí)間的延長(zhǎng)，ICAM-1蛋白的表達(dá)逐漸增高

7、，24h達(dá)到高峰；各時(shí)點(diǎn)之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 4、肺VEC E—選擇素蛋白表達(dá)的變化 在6h和12h時(shí)點(diǎn)上，膿毒癥組大鼠肺VEC E—選擇素蛋白的表達(dá)高于治療組(p<0.01)和對(duì)照組(p<0.01)；治療組大鼠肺VEC E—選擇素蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組(p<0.05)。在24h時(shí)點(diǎn)各組之間E一選擇素蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。膿毒癥組和治療組E—選擇素蛋白的表達(dá)6h達(dá)到高峰，12h

8、回落，24h基本與對(duì)照組在同一水平；各時(shí)點(diǎn)之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 5、肺組織ICAM-1 mRNA表達(dá)的變化 在6h、12h和24h時(shí)點(diǎn)上，膿毒癥組大鼠肺組織ICAM-1 mRNA的表達(dá)高于治療組(p<0.01)和對(duì)照組(p<0.01)，治療組大鼠肺組織ICAM-1 mRNA的表達(dá)高于對(duì)照組(p<0.05)。膿毒癥組和治療組隨著建模時(shí)間的延長(zhǎng)，ICAM-1 mRNA的表達(dá)逐漸增高，24h達(dá)到高峰；各

9、時(shí)點(diǎn)之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 6、肺組織E—選擇素mRNA表達(dá)的變化 在6h和12h時(shí)點(diǎn)上，膿毒癥組大鼠肺組織E—選擇素mRNA的表達(dá)明顯高于治療組(p<0.01)和對(duì)照組(p<0.01)，治療組大鼠肺組織E—選擇素mRNA的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(p<0.05)。在24h時(shí)點(diǎn)各組之間E—選擇素mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。膿毒癥組和治療組E—選擇素mRNA的表達(dá)6h達(dá)到高峰，12h回落

10、，24h基本與對(duì)照組在同一水平；6h、12h和24h各時(shí)點(diǎn)之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。 7、肺組織光鏡下的變化 對(duì)照組肺部組織結(jié)構(gòu)正常。膿毒癥組肺泡壁增厚及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管擴(kuò)張，肺間質(zhì)水腫，肺泡腔及小血管內(nèi)紅細(xì)胞聚集。隨著建模時(shí)間的延長(zhǎng)，可見肺泡間隔增寬斷裂，肺泡腔內(nèi)可見大量的紅細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。治療組與膿毒癥組相比，肺水腫及細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象有明顯的改善。 8、肺組織電子顯微鏡下的變化

11、 對(duì)照組肺部組織結(jié)構(gòu)正常，肺VEC形態(tài)正常。膿毒癥組肺VEC內(nèi)出現(xiàn)空泡、細(xì)胞器腫脹、細(xì)胞器溶解等壞死表現(xiàn)，以及核染色質(zhì)邊集、核碎裂、核膜破裂等凋亡表現(xiàn)；同時(shí)可見肺微血管基底膜增厚，細(xì)胞間隙水腫，肺泡壁增厚及毛細(xì)血管擴(kuò)張，肺間質(zhì)水腫，紅細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等表現(xiàn)。隨著建模時(shí)間的延長(zhǎng)，上述表現(xiàn)逐漸加重，肺泡間隔增寬斷裂，肺泡腔內(nèi)大量的紅細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。治療組與膿毒癥組相比，肺VEC壞死和凋亡比例相對(duì)較少，肺水腫及細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象相對(duì)較