
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文檔簡介
1、第一部分:血管緊張素Ⅱ對肺微血管內(nèi)皮細胞Apelin-APJ mRNA表達的影響
目的:研究血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)對肺微血管內(nèi)皮細胞Apelin-APJ mRNA表達的影響。
方法:培養(yǎng)新生鼠肺微血管內(nèi)皮細胞(PMVECs),利用RT-PCR檢測PMVECsApelin-APJmRNA表達。取2-4代細胞,以5×105個/孔密度接種至6孔板,培養(yǎng)至80%融合后,進行藥物干預實驗:①加AngⅡ入6孔板中,至終
2、濃度分別為0、10-9、10-8、10-7、10-6(mol/L),每組設立4個復孔,繼續(xù)培養(yǎng)24h終止實驗,檢測不同濃度AngⅡ對PMVECsApelin-APJ mRNA表達的影響;②加AngⅡ入6孔板至終濃度為10-7M,分別在0h、1h、6h、12h、24h、48h時間點終止實驗。同時在0h、24h、48h點設立空白對照,加入等體積PBS。每組4個復孔。檢測不同時間點10-7MAngⅡ對PMVECsApelin-APJ mRNA
3、表達。
結果:①PMVECs存在Apelin-APJ mRNA表達。②與對照組(OMAngⅡ)比較,10-9MAngⅡ作用24h后ApelinmRNA表達上調(diào)(P<0.01),隨著AngⅡ濃度上升,Apelin mRNA表達呈濃度依賴性持續(xù)下調(diào)(P<0.05或P<0.01);不同濃度AngⅡ(10-9-10-6M)呈濃度依賴性導致APJmRNA表達下降(P<0.05或P<0.01)。③10-7MAngⅡ作用于PMVECs后
4、,Apelin mRNA表達在6h內(nèi)增加(P<0.05),其中在1h達到高峰(P<0.01),6h后Apelin mRNA表達隨時間延長明顯降低(P<0.01);APJmRNA表達在0h-12h內(nèi)有增加趨勢,12h后APJ mRNA表達隨10-7MAngⅡ作用時間延長明顯下調(diào)(P<0.01):0h、24h、48h時間點空白對照Apelin-APJ mRNA表達無明顯改變(P>0.05)。
結論:AngⅡ對PMVECsApe
5、lin-APJ基因表達水平有明顯影響,Apelin-APJ系統(tǒng)可能參與AngⅡ對內(nèi)皮細胞損傷機制。
第二部分:Apelin對肺血管內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響
目的:探討Apelin對肺血管內(nèi)皮細胞增殖與凋亡的影響。
方法:培養(yǎng)新生大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞(PMvECs),取2-4代PMVECs用于實驗:①以2000個/孔的密度接種至96孔板,分為3組:對照組加入等容量PBS;低濃度組(10-6MApe
6、lin組)加入10-8MApelin;高濃度組(10-6MApelin組)加入10-6MApelin。每組6個復孔。48h后用四甲基偶氮唑藍比色法(MTT法)檢測各組OD值,計算細胞增殖率。②以5×105傳代至25ml的培養(yǎng)瓶,分為5組:對照組加入等容量PBS;低濃度組(10-8MApelin組)加入10-8MMapelin;高濃度組(10-6MApelin組)加入10-16MApelin;AngⅡ組加入10-7MAngⅡ;AngⅡ+A
7、pelin組加入10-8MApelin,10min后加入10-7MAngⅡ。每組5個復孔。24h后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
結果:①與對照組比較,低濃度Apelin和高濃度Apelin都可導致PMVECsOD值增加,增殖率增加2.5倍以上(P<0.01)。低濃度組和高濃度組之間沒有統(tǒng)計學差異。②與對照組比較,低濃度Apelin組和高濃度Apelin組的PMVECs凋亡率降低50%以上(P<0.05),AngⅡ組PMVE
8、Cs凋亡率明顯升高(P<0.01);與AngⅡ組比較,AngⅡ+Apelin組PMVECs凋亡率明顯降低(P<0.01)。
結論:Apelin促進體外培養(yǎng)大鼠PMVECs增殖,抑制PMvECs凋亡。
第三部分:Apelin對肺微血管內(nèi)皮細胞保護作用及其釋放№的機制研究
目的:探討Apelin對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導肺血管內(nèi)皮細胞釋放ET-1的影響和刺激一氧化氮(NO)的釋放機制。
9、 方法:培養(yǎng)新生鼠肺微血管內(nèi)皮細胞(PMVECs),取2-4代PMVECs用于實驗。
①Apelin在不同時間點對PMVECs釋放NO的影響:以1×105個/孔密度接種至24孔板,80%融合后,無血清培養(yǎng)24h,分為2組:Apelin組,加入Apelin至終濃度為10-8M;對照組,加入等量無血清DMEM培養(yǎng)液。每組設立4個復孔。繼續(xù)培養(yǎng),并分別在0min、2min、5min、15min、30min五個時間點取培養(yǎng)液測
10、NO濃度。
②Apelin對AngⅡ誘導PMVECs釋放ET-1的影響:分為4組:AngⅡ組,加入AngⅡ至終濃度為10-7M;AngⅡ+10-8MApelin組,加入10-7MAngll前5min加入10-8MApelin預處理;AngⅡ+10-6MApelin組,加入10-7MAngⅡ前5min加入10-6MApelin預處理;對照組,加入等量無血清DMEM培液。每組設立4個復孔。繼續(xù)培養(yǎng),并分別在0min、30min
11、、6h、24h四個時間點取培養(yǎng)液檢測ET-1濃度。
③Apelin對PMVECsAkt/eNOS磷酸化影響:以5×105個/孔密度接種至6孔板,80%融合后,無血清培養(yǎng)24h,分為3組:Apelin組,加入Apelin至終濃度為10-8M;Apelin+Aktinhibitor組,加入Apein前用5ug濃度的Akt抑制劑預處理30min;對照組,加入等量DMEM培液。每組設立3復孔。繼續(xù)培養(yǎng)5min后立即提取總蛋白,用于
12、Western Bolt檢測磷酸化Akt和磷酸化eNOS表達。
結果:
①Apelin在不同時間點對PMVECs釋放NO的影響:
在PMVECs培養(yǎng)液中加入10-8M的Apelin后,與對照組比較,培養(yǎng)液中NO濃度在2min、5min、15min時間點都出現(xiàn)增加(P<0.01或P<0.05);其中在5min時間點達到高峰(與對照組比較,P<0.01);在30min時間點,NO濃度與對照組比較無統(tǒng)
13、計學差異。
②Apelin對AngⅡ誘導PMVECs釋放ET-1的影響:
與對照組比較,AngⅡ組培養(yǎng)液中30min、6h、24h時間點的ET-1濃度都明顯升高(P<0.05)。與AngⅡ組比較,AngⅡ+10-8MApelin組培養(yǎng)液中30min、6h、24h時間點的ET-1濃度都明顯降低(P<0.05),接近對照組。與AngⅡ組比較,AngⅡ+10-6Apelin組的ET-1濃度有降低趨勢,但無統(tǒng)計學意義
14、。
③Apelin對PMVECsAkt/eNOS磷酸化影響:
與對照組比較,Apelin組PMVECsAkt和eNOS磷酸化表達明顯增加(P<0.01)。與Apelin組比較,Apelin+Aktinhibitor組PMVECseNOS磷酸化表達明顯降低(P<0.01)。
結論:Apelin能促進PMVECs釋放NO,抑制AngⅡ誘導的ET-1釋放。Akt/eNOS磷酸化增加是Apelin促進N
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