蒲黃提取物對(duì)OX-LDL損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的研究.pdf

1、背景
　　 動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是多種心血管疾病的共同病理基礎(chǔ),嚴(yán)重威脅著人們的健康。研究表明血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是AS發(fā)生的先決條件及重要機(jī)制。氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)作為AS發(fā)生的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素之一,可引起血管內(nèi)膜損傷,誘導(dǎo)各種黏附分子的表達(dá),從而促進(jìn)單核細(xì)胞與動(dòng)脈內(nèi)膜的黏附、遷移并吞噬脂質(zhì)成為泡沫細(xì)胞,這些病理變化在人類動(dòng)

2、脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展中起到非常關(guān)鍵的作用。因此,保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞是AS防治的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　 蒲黃(Pollen Typhae)為香蒲科植物水燭香蒲、東方香蒲或其同屬植物的花粉。其藥用歷史悠久,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。具有活血化瘀、利尿的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,蒲黃具有降血脂、抗血小板聚集與抗血栓等作用,從而起到抗AS,治療冠心病的作用。鑒于蒲黃防治動(dòng)脈硬化的有效性,本研究以體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的方法,采用氧化

3、低密度脂蛋白造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型,通過測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH),超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1),單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)等指標(biāo)的變化,探討蒲黃提取物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 方法
　　 1.培養(yǎng)原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞:取健康產(chǎn)婦分娩胎兒的臍帶,用胰酶和EDTA混合消化液注入臍靜脈內(nèi)進(jìn)行消化,以形態(tài)學(xué)觀察和Ⅷ因子免疫熒光法進(jìn)行鑒定。
　　 2.M

4、TT法檢測(cè)蒲黃提取物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響:將內(nèi)皮細(xì)胞分為6組接種于96孔板:5個(gè)不同濃度藥物組(100mg/L、75mg/L、50mg/L、25mg/L、10mg/L)和1個(gè)空白對(duì)照組。分別于培養(yǎng)24、48、72 h后加入MTT液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并檢測(cè)光密度值(OD值)。
　　 3.蒲黃提取物抗內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷、炎癥損傷的研究:按照隨機(jī)化分組的原則,將細(xì)胞分為五組接種于24孔板,每組4個(gè)復(fù)孔。第一組為空白對(duì)照組:培養(yǎng)液為DMEM液;第二

5、組為Ox-LDL致傷組:培養(yǎng)液為含100mg/L Ox-LDL的DMEM液;第三、四、五組分別為蒲黃提取物低、中、高濃度組:先用含10、50、100mg/L蒲黃提取物的DMEM培養(yǎng)液預(yù)處理24小時(shí),再加入100mg/L Ox-LDL的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h;最后收集細(xì)胞及培養(yǎng)液待測(cè)指標(biāo)。用比色法檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH、SOD、MDA的活力,用RT-PCR法測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1 mRNA、MCP-1 mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果

6、　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定結(jié)果
　　 (1)形態(tài)學(xué)觀察:HUVEC接種于培養(yǎng)瓶5-7天后細(xì)胞己基本融合,呈特征性的“鋪路石”樣鑲嵌排列。(2)Ⅷ因子抗體免疫熒光技術(shù)鑒定:顯微鏡下可見95％以上的細(xì)胞質(zhì)呈綠色發(fā)亮熒光。以上結(jié)果證明培養(yǎng)的細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 2.MTT法檢測(cè)蒲黃提取物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響
　　 蒲黃提取物各濃度組(100mg/L、75mg/L、50mg/L、25mg/L、10mg/L)作用24

7、、48、72h與同一時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組相比,OD值顯著增加(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01),但各濃度組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可見蒲黃提取物在上述濃度范圍內(nèi)對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞無毒副作用,且具有明顯的促增殖作用。
　　 3.蒲黃提取物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞LDH、MDA、SOD活性的影響
　　 Ox-LDL損傷組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、MDA活性明顯升高,SOD活性明顯下降,與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異(P＜0.01)

8、;蒲黃提取物呈濃度依賴性地降低了LDH、MDA活性,提高SOD的活力,與Ox-LDL損傷組比較,具有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 4.蒲黃提取物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1 mRNA、MCP-1 mRNA表達(dá)的影響
　　 Ox-LDL損傷組細(xì)胞ICAM-1 mRNA和MCP-1 mRNA的表達(dá)顯著增加,與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異(P＜0.01);蒲黃提取物各濃度組均能顯著地降低內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1 mRNA和MCP-

9、1 mRNA的表達(dá)(P＜0.01)。
　　 結(jié)論
　　 1.蒲黃提取物對(duì)體外培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞無毒副作用,且具有明顯的促增殖作用。
　　 2.蒲黃提取物可通過提高細(xì)胞培養(yǎng)液SOD的活性,降低MDA的表達(dá)起到了抗氧化損傷的作用,并可以通過抑制了LDH的釋放,起到保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。
　　 3.蒲黃提取物可通過下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)mRNA的表