茶多酚抑制ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制研究.pdf

1、目的：茶多酚(Tea Polyphenols，TP)是從茶葉中提取的多酚類物質(zhì)，是茶葉中的主要活性成分。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明茶多酚是一種天然抗氧化劑，具有較強(qiáng)的抗氧化性。低密度脂蛋白(LOW density lipoprotein，LDL)在體內(nèi)外都可被氧化修飾成氧化型LDL(Oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)，研究表明ox-LDL具有細(xì)胞毒性作用，且能促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成，認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生

2、的始動(dòng)因子。體內(nèi)外研究都發(fā)現(xiàn)ox-LDL的氧化應(yīng)激作用所致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷是其細(xì)胞毒性的主要體現(xiàn)形式之一。本實(shí)驗(yàn)將銅離子誘導(dǎo)LDL氧化修飾的ox-LDL作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells．HuVEC)，觀察了OX-IDL對(duì)HUVEC的生長(zhǎng)抑制作用，并通過在蛋白質(zhì)水平和mRNA水平微管骨架蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)和分析，探討OX-LDL促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的機(jī)制，試圖尋找有效

3、降低動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生率的干預(yù)措施，并為茶多酚的進(jìn)一步廣泛應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。 方法首先采用銅離子誘導(dǎo)法將LDL氧化修飾為ox-LDL。復(fù)蘇后HUVEC置于37℃，5％CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HuVEC分為對(duì)照組和三個(gè)實(shí)驗(yàn)組：茶多酚組、ox-LDL+茶多酚組、ox-LDL組。茶多酚和ox-LDL在培養(yǎng)體系中的終濃度分別為251μg/ml和200μg/ml，對(duì)照組加入等體積的PBS。加入茶多酚和ox-LDL培養(yǎng)4

4、8h后，采用四唑鹽(Methyl thiazolvltetrazolium，MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞活性、吖啶橙熒光染色觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，DNA Ladder分析DNA斷裂情況，分別采用十二烷基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)及Western blotting、免疫細(xì)胞化學(xué)方法分析凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2

5、、BaX和caspase-3以及微管蛋白α-tubulin和β-tubulin的表達(dá)。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)bc1-2、Bax、caspase-3、α-tubulin和β-tubulin mRNA水平的改變。 結(jié)果 1．茶多酚和OX-LDL對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 HUVEC給予OX-LDL和/

6、或茶多酚處理48h后，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，OX-LDL可明顯抑制HUVEC的生長(zhǎng)(40.0％，P<0.05)，加入茶多酚后則明顯降低OX-LDL所致的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制(7.8％，P>0.05)。 2．茶多酚及OX-LDL對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 將不同組細(xì)胞分別用吖啶橙熒光染色，熒光顯微鏡下觀察對(duì)照組、茶多酚組細(xì)胞核呈圓形，結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)較規(guī)則。加入OX-LDL后，細(xì)胞變得不規(guī)則，細(xì)胞核可見濃染致密的顆粒塊狀熒光，

7、聚集在細(xì)胞邊緣，呈新月牙形排列，并可見熒光碎片。給予OX-LDL的同時(shí)給予茶多酚，細(xì)胞基本正常，其中偶見細(xì)胞核內(nèi)呈新月牙形排列的熒光。 3．DNA Ladder結(jié)果 DNA Ladder結(jié)果觀察Nox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)“l(fā)adder”現(xiàn)象，提示HUVEC發(fā)生DNA斷裂。同時(shí)給予茶多酚，“l(fā)adder”現(xiàn)象明顯減弱，提示DNA斷裂情況被抑制。 4．凋亡相關(guān)蛋白Bc1-2、Bax、caspase-3和微管蛋白α

8、-mbulin和β-mbulin蛋白表達(dá)的檢測(cè) 5.RT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3和微管蛋白α-tubulin和β-tubulin Mrna水平的變化 Ox-LDL和茶多酚對(duì)HUVEC Bcl-2、Bax和β-tubulin Mrna水平的影響與其對(duì)蛋白質(zhì)水平的影響基本一致，但對(duì)caspase-3和α-tubulin Mrna作用卻不同。 首先，ox-LDL顯著降低了Bcl-2

9、 Mrna水平(28％，P<0.01)，使Bax Mrna水平升高33％(P<0.01)。但是ox-LDL對(duì)caspase-3 Mrna的影響與對(duì)照組相比沒有顯著差異(P>0.05)。茶多酚與ox-LDL共同作用以后，Bcl-2 Mrna水平升高，Bax Mrna和caspase-3 Mrna水平降低都不明顯(與ox-LDL組相比，P>0.05)。 其次，OX-LDL能顯著降低HUVECβ-tubulin Mrna水平(27

10、％，P<0.01)，茶多酚與OX-LDL共同作用以后，β-tubulinmRNA水平升高了14％(P<0.05)。無論OX-LDL還是茶多酚對(duì)僅α-tubulin Mrna水平的影響都沒有顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論 1.0x-LDL具有明顯的細(xì)胞毒性，能引起HUVEC細(xì)胞骨架破壞，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 2.0x-LDL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)和Mrna水平改變有

11、關(guān)。 3.0x-LDL的細(xì)胞毒性也表現(xiàn)為對(duì)微管蛋白儀α-tubulin和β-tubulin的影響，且在蛋白質(zhì)水平改變要比在Mrna水平改變明顯。 4.首次觀察到茶多酚對(duì)OX-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡有抑制作用，可能是逆轉(zhuǎn)了Bcl-2、Bax和caspase-3 Mrna和蛋白表達(dá)，抑制了DNA斷裂，最終表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征消失。 5.首次觀察到茶多酚對(duì)OX-LDL誘導(dǎo)的HUVEC微管蛋白α-tubulin和