Ghrelin對ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　通過建立ox-LDL體外誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型,觀察ox-LDL對血管內(nèi)皮細(xì)胞功能和形態(tài)的影響,探討Ghrelin對ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和功能損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制,為 Ghrelin應(yīng)用于動脈粥樣硬化疾病的治療提供理論及實踐依據(jù)。
　　方法:
　　1.采用細(xì)胞消化方法從足月新生兒臍靜脈分離內(nèi)皮細(xì)胞后,于含20％胎牛血清的M199完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)傳代。傳至第4-5代的人臍靜脈內(nèi)皮

2、細(xì)胞分別進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色和人VIII因子相關(guān)抗原免疫組化檢測。
　　2.實驗包括劑量因素分析與時間因素分析兩個方面,各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞孵育24h后,分別收集內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液,以Hoechest33258染色、Western-blot法和硝酸還原酶法檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況,細(xì)胞中 caspase-3蛋白水平和一氧化氮含量。采用ELISA法分別檢測內(nèi)皮細(xì)胞中IL-6、IL-8和TNF-α的表達(dá)水平。提取細(xì)胞的總RNA,采用

3、半定量RT-PCR方法檢測細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血管黏附分子-1(VCAM-1)基因在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的含量。
　　結(jié)果:
　　1. Ghrelin拮抗ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡
　?、?Hoechst33258染色熒光檢測發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,ox-LDL組HUVEC中出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞,凋亡率明顯增加(p<0.01),細(xì)胞核染色質(zhì)固縮,聚集于核膜下或碎裂成致密的顆粒狀,呈亮藍(lán)色強(qiáng)熒光;與

4、 ox-LDL組比較,1、10、100ng/ml Ghrelin預(yù)處理組HUVEC細(xì)胞凋亡率分別降低30%、44%、56%,1h、6h、12h Ghrelin預(yù)處理組凋亡率分別降低40%、60%、72%,各組間差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　② Western-blot檢測表明, ox-LDL可上調(diào)細(xì)胞中caspase-3表達(dá)(P<0.01);而經(jīng)過 Ghrelin預(yù)處理后,1、10、100ng/ml組 HUVEC

5、細(xì)胞中 ox-LDL所誘導(dǎo)的caspase-3表達(dá)分別降低17%、23%、45%,1h、6h、12h組則分別降低32%、47%、52%,組間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　?、巯跛徇€原酶法顯示,ox-LDL可顯著減少內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);經(jīng)過Ghrelin預(yù)處理后,相較于ox-LDL組,1、10、100ng/ml組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量分別增加25%、54%、85%,1h、6h、12h組

6、則分別增加30%、46%、68%,各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　2. Ghrelin抑制ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)
　　①ELISA結(jié)果顯示,ox-LDL組IL-6表達(dá)水平較對照組顯著增加(P<0.01);而與ox-LDL組比較,1、10、100ng/ml Ghrelin預(yù)處理組IL-6表達(dá)分別降低19%、35%、60%,1h、6h、12h Ghrelin預(yù)處理組則分別降低36%、45%

7、、56%,各組間比較差異均有顯著性(P<0.01或0.05)。
　?、?ox-LDL組IL-8含量較對照組顯著增加(P<0.01);經(jīng)過Ghrelin預(yù)處理后,1、10、100ng/ml組IL-8水平分別降低31%、52%、84%,1h、6h、12h組則分別降低56%、68%、79%,組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或0.05)。
　?、?Ghrelin預(yù)處理抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中TNF-α表達(dá)(P<0.0

8、5),相對于ox-LDL組,1、10、100ng/ml Ghrelin組TNF-α表達(dá)水平分別降低7%、19%、30%,組間比較有顯著差異(P<0.05);1h、6h、12h Ghrelin組TNF-α表達(dá)含量分別降低18%、28%、33%,其中6h和12h組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　3.Ghrelin抑制ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)
　　①半定量RT-PCR結(jié)果表明,ox-LDL組內(nèi)皮細(xì)胞

9、VCAM-1表達(dá)水平較空白對照組明顯升高(P<0.05),而1、10、100ng/ml Ghrelin預(yù)處理可使內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1 mRNA含量,相較于ox-LDL組分別減少33%、52%、63%,1h、6h、12h Ghrelin預(yù)處理組則分別減少48%、65%、72%,其中10ng/ml與100ng/ml組,6h與12h組之間比較無顯著差異(P>0.05)。
　?、?RT-PCR結(jié)果顯示,ox-LDL可顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞中IC

10、AM-1表達(dá),與空白對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),Ghrelin預(yù)處理可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1 mRNA表達(dá)(P<0.05),其中1、10、100ng/ml Ghrelin預(yù)處理組減少百分比分別為18%、46%、57%,1h、6h、12h Ghrelin預(yù)處理組則分別降低48%、63%、69%,其是10ng/ml與100ng/ml組,6h與12h組之間ICAM-1 mRNA水平比較差異無顯著性(P>0.