Ox-LDL誘導早期巨噬細胞源泡沫細胞形成和損傷中相關(guān)動力學機制研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種多因素疾病，與多種危險因子包括血脂紊亂、糖尿病、肥胖和高血壓有關(guān)，重要的基本病理改變是氧化低密度脂蛋白(oxidizedlow-densitylipoprotein，Ox-LDL)在血管壁的積聚，其中巨噬細胞在血管壁的脂質(zhì)代謝中起著關(guān)鍵而復雜的作用。在早期脂質(zhì)浸潤中，巨噬細胞通過清道夫受體(CD36等)攝取Ox-LDL，形成泡沫細胞，大量積聚的Ox-LDL引起細胞毒性使細胞產(chǎn)生大

2、量炎癥因子，改變了細胞的形態(tài)和信號轉(zhuǎn)導，進而損傷細胞影響動脈粥樣硬化的發(fā)展。因此，早期AS最基本的病理特征之一就是巨噬源泡沫細胞的形成和損傷，但目前其形成和損傷的時間和空間動力學機理仍不清楚。 本研究以PMA誘導人單核細胞U937源的巨噬細胞為靶細胞，通過Ox-LDL誘導的巨噬細胞源泡沫細胞模型，利用流式細胞術(shù)、激光共聚焦顯微術(shù)和分子生物學技術(shù)等實驗技術(shù)，結(jié)合動力學分析方法，研究了動脈粥樣硬化早期巨噬細胞源泡沫細胞形成和損傷的相

3、關(guān)動力學機制。 本研究分別在Ox-LDL急性和慢性刺激等不同條件下，對影響泡沫細胞形成的部分關(guān)鍵因子膽固醇酯(CE)、總膽固醇(TC)、CD36、CD54和F-actin，以及[Ca2+]i等進行了時間和空間上的相關(guān)動力學研究。研究結(jié)果顯示，1)在慢性刺激下，Ox-LDL能顯著以時間依賴的方式誘導細胞內(nèi)CE和TC的升高(P＜0.01)，尤其在24h時(CE/TC)％＞50％，表明了Ox-LDL誘導早期泡沫細胞形成的時間動力學變化

4、，即Ox-LDL刺激24h后形成典型巨噬細胞源泡沫細胞；2)在急性和慢性刺激下，Ox-LDL能顯著誘導[Ca2+]i的升高，但在急性刺激時，胞外液無論在有無Ca2+存在的情況下，[Ca2+]i都呈不同程度的升高，且在空間上形成明顯的跨膜Ca2+梯度變化；3)在慢性刺激下，Ox-LDL以時間依賴的方式誘導細胞表面CD54和CD36表達的升高，以及F-actin時間和空間上多聚化的改變； 另外，本研究還分別在Ox-LDL急性和慢性刺

5、激等不同條件下，對影響泡沫細胞內(nèi)線粒體損傷的部分關(guān)鍵因子H2O2、NO和O2-、線粒體呼吸、線粒體膜電位(△ψm)、谷胱甘肽(GSH)和Bcl-2蛋白的表達、以及細胞的凋亡和壞死等進行了相關(guān)動力學研究。研究結(jié)果顯示，1)在急性和慢性刺激下，Ox-LDL能顯著以時間依賴的方式誘導細胞內(nèi)NO和O2·-升高，動力學數(shù)據(jù)分析表明，在Ox-LDL急性刺激時，細胞內(nèi)NO的升高明顯高于O2·-的升高，且在2min以后細胞內(nèi)O2·-的升高明顯變緩，但急

6、性刺激時細胞內(nèi)H2O2則隨時間持續(xù)升高，而在慢性刺激情況下24h時則顯示明顯降低；2)在慢性刺激時，Ox-LDL隨時間誘導了線粒體呼吸的降低，△ψm的超極化，引起ROS和GSH的適應(yīng)性升高，但在24h后則顯示了△ψm部分去極化，ROS和GSH明顯降低；3)在慢性刺激下，Ox-LDL顯著以時間依賴的方式誘導細胞凋亡和壞死，12h和24h時細胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達同對照相比分別增加了500-600％和300-400％，但同12h相比Bcl-

7、2表達在24h時有所下降。 綜上所述，本研究的結(jié)論及主要創(chuàng)新點是：1)在早期巨噬細胞源泡沫細胞形成過程中，Ox-LDL誘導的[Ca2+]i快速升高是較早發(fā)生的細胞事件之一，使Ca2+能快速參與細胞功能的調(diào)節(jié)，同時細胞內(nèi)隨時間大量表達CD36和CD54等表面受體，細胞骨架蛋白發(fā)生空間和時間上多聚化改變，影響細胞的內(nèi)吞和粘附，導致細胞在24h后形成典型泡沫細胞；2)在早期巨噬細胞源泡沫細胞損傷過程中，在12h內(nèi)細胞內(nèi)線粒體△ψm發(fā)生

8、超極化，細胞內(nèi)GSH適應(yīng)性升高，并且啟動了細胞核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄表達了大量Bcl-2蛋白等細胞保護機制；同時又產(chǎn)生大量的RNS(NO)和ROS(O2-和H2O2等)等自由基，損傷線粒體呼吸，導致細胞凋亡和壞死；3)還發(fā)現(xiàn)隨著細胞損傷的加劇，24h時線粒體△ψm有部分去極化，H2O2等ROS和GSH生成、以及Bcl-2蛋白表達隨時間減少，線粒體呼吸、線粒體相關(guān)的細胞凋亡隨時間進一步加重，表明線粒體功能的動態(tài)紊亂過程在早期動脈粥樣硬化損傷中起著關(guān)