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文檔簡介
1、背景及目的:細胞焦亡是一種依賴半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Cysteine aspartate-specific protease-1,caspase-1)活化的高炎癥性細胞死亡形式,氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL)可誘導巨噬細胞發(fā)生caspase-1介導的細胞焦亡,在動脈粥樣硬化進展期不穩(wěn)定斑塊形成中發(fā)揮重要作用。
細胞自噬是細胞利用膜結(jié)構(gòu)將需要降解的細胞器或蛋
2、白等進行包裹形成自噬體,隨后與溶酶體結(jié)合將其降解。缺乏自噬會導致活性氧簇ROS的產(chǎn)生及NLRP3炎癥小體的活化,引起caspase-1介導的細胞焦亡。BNIP3基因家族是一個獨特的Bcl-2家族 BH3-only家族成員,包括 BNIP3,NIX(也叫 BNIP3L基因)。NIX定位于線粒體外膜,可與自噬相關(guān)蛋白(LC3和GABARAP等)結(jié)合,誘導線粒體自噬發(fā)生并降解清除多余的線粒體。NIX介導的線粒體自噬途徑在哺乳細胞對損傷線粒體的
3、降解中也發(fā)揮關(guān)鍵作用。
我們前期研究表明ox-LDL作用于巨噬細胞后,對巨噬細胞自噬及細胞焦亡都產(chǎn)生影響。同時,隨著 ox-LDL的作用濃度增加,NIX的表達也隨之增多。表明NIX對巨噬細胞線粒體自噬有一定的調(diào)控作用。但 NIX介導的線粒體自噬對ox-LDL誘導巨噬細胞焦亡的影響及機制目前尚不清楚。
方法:
1、ox-LDL作用于巨噬細胞J774A.1,通過RT-PCR檢測NIX mRNA表達水平;west
4、ern-blot檢測NIX蛋白的表達情況,篩選合適的ox-LDL作用濃度和時間。
2、采用western-blot檢測ox-LDL作用后LC3-Ⅱ/Ⅰ及NIX的表達情況。線粒體自噬的檢測用激光共聚焦觀察 LC3、NIX、線粒體共定位的情況;采用小干擾RNA沉默NIX表達觀察對ox-LDL誘導線粒體自噬的影響;
3、細胞焦亡的檢測。采用 LDH釋放試劑盒檢測 LDH的釋放,熒光顯微鏡觀察細胞AO/EB的染色情況,wes
5、tern-blot檢測caspase-1 p10、IL-1β的表達情況;以及沉默NIX表達后對ox-LDL誘導巨噬細胞焦亡的影響;
4、采用DCFH-DA染色流式細胞儀檢測ox-LDL作用前后細胞內(nèi)ROS的水平;采用western-blot檢測NLRP3炎癥小體的表達情況,以及沉默NIX表達后對ROS的水平和NLRP3活化的影響;
結(jié)果:
1、本研究顯示ox-LDL處理巨噬細胞J774A.1后,NIX mR
6、NA和蛋白的表達水平隨著ox-LDL作用濃度的增高相應增加,并在100μg/ml增加幅度最大;在確定100μg/ml ox-LDL作用后隨著時間的增加,檢測NIX的表達情況也相應增加,其中6小時的增幅最高。
2、ox-LDL作用于巨噬細胞J774A.1后,Western-blot結(jié)果表明LC3-П/Ⅰ的表達增多;激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果表明NIX、自噬體LC3、線粒體三者存在共定位關(guān)系;運用 siRNA干擾技術(shù)靶向沉默 NIX
7、,抑制 NIX的功能后,自噬通路中的自噬體LC3蛋白表達水平均較正常組減少。
3、沉默NIX后,應用ox-LDL作用于巨噬細胞中,結(jié)果發(fā)現(xiàn),LDH的釋放和AO/EB染色陽性細胞所占百分比較正常組顯著升高;caspase-1 p10和IL-1β蛋白的表達呈增高的趨勢。
4、沉默NIX后,應用ox-LDL作用于巨噬細胞中,ROS水平增加(90.5±0.48)%大于J774A.1組(69.3±0.75)%。NLRP3炎癥小
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