NIX介導(dǎo)的線粒體自噬對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡(pyroptosis)的影響.pdf

1、背景及目的：細(xì)胞焦亡是一種依賴半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Cysteine aspartate-specific protease-1,caspase-1)活化的高炎癥性細(xì)胞死亡形式，氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL）可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展期不穩(wěn)定斑塊形成中發(fā)揮重要作用。
　　細(xì)胞自噬是細(xì)胞利用膜結(jié)構(gòu)將需要降解的細(xì)胞器或蛋

2、白等進(jìn)行包裹形成自噬體，隨后與溶酶體結(jié)合將其降解。缺乏自噬會(huì)導(dǎo)致活性氧簇ROS的產(chǎn)生及NLRP3炎癥小體的活化，引起caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。BNIP3基因家族是一個(gè)獨(dú)特的Bcl-2家族 BH3-only家族成員，包括 BNIP3，NIX（也叫 BNIP3L基因）。NIX定位于線粒體外膜，可與自噬相關(guān)蛋白（LC3和GABARAP等）結(jié)合，誘導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生并降解清除多余的線粒體。NIX介導(dǎo)的線粒體自噬途徑在哺乳細(xì)胞對(duì)損傷線粒體的

3、降解中也發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　我們前期研究表明ox-LDL作用于巨噬細(xì)胞后，對(duì)巨噬細(xì)胞自噬及細(xì)胞焦亡都產(chǎn)生影響。同時(shí)，隨著 ox-LDL的作用濃度增加，NIX的表達(dá)也隨之增多。表明NIX對(duì)巨噬細(xì)胞線粒體自噬有一定的調(diào)控作用。但 NIX介導(dǎo)的線粒體自噬對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡的影響及機(jī)制目前尚不清楚。
　　方法：
　　1、ox-LDL作用于巨噬細(xì)胞J774A.1，通過RT-PCR檢測(cè)NIX mRNA表達(dá)水平；west

4、ern-blot檢測(cè)NIX蛋白的表達(dá)情況，篩選合適的ox-LDL作用濃度和時(shí)間。
　　2、采用western-blot檢測(cè)ox-LDL作用后LC3-Ⅱ/Ⅰ及NIX的表達(dá)情況。線粒體自噬的檢測(cè)用激光共聚焦觀察 LC3、NIX、線粒體共定位的情況；采用小干擾RNA沉默NIX表達(dá)觀察對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)線粒體自噬的影響；
　　3、細(xì)胞焦亡的檢測(cè)。采用 LDH釋放試劑盒檢測(cè) LDH的釋放，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞AO/EB的染色情況，wes

5、tern-blot檢測(cè)caspase-1 p10、IL-1β的表達(dá)情況；以及沉默NIX表達(dá)后對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡的影響；
　　4、采用DCFH-DA染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)ox-LDL作用前后細(xì)胞內(nèi)ROS的水平；采用western-blot檢測(cè)NLRP3炎癥小體的表達(dá)情況，以及沉默NIX表達(dá)后對(duì)ROS的水平和NLRP3活化的影響；
　　結(jié)果:
　　1、本研究顯示ox-LDL處理巨噬細(xì)胞J774A.1后，NIX mR

6、NA和蛋白的表達(dá)水平隨著ox-LDL作用濃度的增高相應(yīng)增加，并在100μg/ml增加幅度最大；在確定100μg/ml ox-LDL作用后隨著時(shí)間的增加，檢測(cè)NIX的表達(dá)情況也相應(yīng)增加，其中6小時(shí)的增幅最高。
　　2、ox-LDL作用于巨噬細(xì)胞J774A.1后，Western-blot結(jié)果表明LC3-П/Ⅰ的表達(dá)增多；激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果表明NIX、自噬體LC3、線粒體三者存在共定位關(guān)系；運(yùn)用 siRNA干擾技術(shù)靶向沉默 NIX

7、，抑制 NIX的功能后，自噬通路中的自噬體LC3蛋白表達(dá)水平均較正常組減少。
　　3、沉默NIX后，應(yīng)用ox-LDL作用于巨噬細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LDH的釋放和AO/EB染色陽性細(xì)胞所占百分比較正常組顯著升高；caspase-1 p10和IL-1β蛋白的表達(dá)呈增高的趨勢(shì)。
　　4、沉默NIX后，應(yīng)用ox-LDL作用于巨噬細(xì)胞中，ROS水平增加（90.5±0.48）%大于J774A.1組（69.3±0.75）%。NLRP3炎癥小