自噬在ox-LDL誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的作用研究.pdf

1、心腦血管疾病是目前人類死亡的主要原因之一，動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)。動脈粥樣硬化由許多因素引起，其發(fā)病機制到目前仍未完全明確，許多研究表明脂代謝異常和血管的炎癥反應(yīng)均參與了動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展。血液中的低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein，LDL)在動脈粥樣硬化的發(fā)生中占有重要位置，LDL可以引起血管內(nèi)皮細胞功能障礙和內(nèi)皮細胞損傷，內(nèi)皮細胞損傷之后可以促進內(nèi)皮細胞表面的ICAM1和VCAM1的表達，使

2、得血液中的單核細胞和內(nèi)皮細胞粘附并向內(nèi)皮下遷移，單核細胞進入動脈內(nèi)膜后，吞噬LDL，并使其氧化轉(zhuǎn)變?yōu)閛x-LDL，同時單核細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉毎＞奘杉毎軌蚍置诙喾N細胞因子，促進血管的局部炎癥反應(yīng)，加重血管內(nèi)皮損傷并最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生和進展。
　　隨著人們對自噬在許多疾病發(fā)展過程中的研究，動脈粥樣硬化斑塊中的自噬現(xiàn)象也引起了人們的關(guān)注。近年的研究顯示，動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的細胞具有一定程度的自噬現(xiàn)象，自噬也是決定其進程的重要影

3、響因素。自噬是真核細胞用來降解和再循環(huán)其胞漿內(nèi)容物的一種方式，基礎(chǔ)水平的自噬在血管功能及形態(tài)的維持中發(fā)揮重要作用。在本研究中，我們觀察ox-LDL能否誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC和單核細胞THP1產(chǎn)生自噬，并初步探討了自噬在ox-LDL誘導(dǎo)的血管局部炎癥反應(yīng)中的作用。
　　第一章自噬在ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)中的作用研究
　　目的:
　　觀察ox-LDL能否誘導(dǎo)HUVEC細胞產(chǎn)生自噬，同時用3-MA抑制

4、自噬，探討自噬對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細胞中ICAM1、VCAM1和MCP-1表達的影響。
　　方法:
　　1.Western-Blot檢測20、40、80μg/ml的ox-LDL作用于HUVEC細胞后LC3的表達變化，免疫熒光檢測LC3蛋白在細胞內(nèi)的分布，從而確定ox-LDL能否誘導(dǎo)HUVEC細胞產(chǎn)生自噬。
　　2.MDC染色檢測20、40、80μg/ml的ox-LDL作用于HUVEC細胞后細胞內(nèi)的酸性囊泡，通

5、過流式細胞儀檢測細胞內(nèi)MDC的熒光強度，熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)的酸性囊泡，進一步明確ox-LDL能否誘導(dǎo)HUVEC細胞產(chǎn)生自噬。
　　3.為了確定自噬對ox-LDL誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響，將實驗分為4組:(1)對照組，培養(yǎng)液培養(yǎng)，作為對照;(2)ox-LDL刺激組(80μg/ml);(3)3-MA組(5mmol/L)，(4)3-MA(5mmol/L)+ox-LDL(80μg/ml)。Western-Blot檢測ox-LDL和3-MA作

6、用后的LC3、ICAM1和VCAM1的表達變化，ELISA檢測MCP-1的表達變化。
　　結(jié)果:
　　1.ox-LDL作用于HUVEC細胞后，可以使LC3的表達明顯增高，并且LCⅠ被剪切成LC3Ⅱ的數(shù)量明顯增多，免疫熒光顯示LC3在細胞內(nèi)的聚集明顯增多，細胞內(nèi)出現(xiàn)典型的點狀熒光，這說明ox-LDL引起了細胞內(nèi)自噬泡的形成。
　　2.流式結(jié)果顯示，ox-LDL作用于HUVEC細胞后，細胞內(nèi)MDC的熒光明顯增強。同時在熒光

7、顯微鏡下觀察顯示，ox-LDL作用于HUVEC細胞后，細胞中被MDC染色的酸性囊泡明顯增多，這些結(jié)果進一步表明ox-LDL可以誘導(dǎo)HUVEC細胞產(chǎn)生自噬。
　　3.Western-blot結(jié)果顯示，ox-LDL可以使HUVEC細胞中的ICAM1和VCAM1的表達增高，當(dāng)3-MA抑制自噬后，ox-LDL誘導(dǎo)的ICAMl和VCAM1的表達會進一步升高;ELISA結(jié)果顯示ox-LDL可以使HUVEC細胞中的MCP-1的表達增高，抑制自噬

8、后，ox-LDL誘導(dǎo)的MCP-1的表達會進一步升高。
　　結(jié)論:
　　ox-LDL可以誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC產(chǎn)生自噬，抑制自噬后，可以使ox-LDL誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)進一步增強，說明自噬對ox-LDL誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)起到一定的保護作用。
　　第二章自噬在ox-LDL誘導(dǎo)的單核細胞炎癥反應(yīng)中的作用研究
　　目的:觀察ox-LDL能否誘導(dǎo)單核細胞THP1細胞產(chǎn)生自噬，同時用3-MA抑制自噬，探討自噬對ox-LDL誘導(dǎo)

9、的THP1細胞中TNF-α、IL-1和IL-6表達的影響。
　　方法:
　　1.Western-Blot檢測20、40、80μg/ml的ox-LDL作用于THP1細胞后LC3的表達變化，免疫熒光檢測LC3蛋白在細胞內(nèi)的分布，確定ox-LDL能否誘導(dǎo)THP1細胞產(chǎn)生自噬。
　　2.MDC染色檢測20、40、80μg/ml的ox-LDL作用于THP1細胞后細胞內(nèi)的酸性囊泡，通過流式細胞儀檢測細胞內(nèi)MDC的熒光強度，熒光顯微

10、鏡觀察細胞內(nèi)的酸性囊泡，進一步明確ox-LDL能否誘導(dǎo)THP1細胞產(chǎn)生自噬。
　　3.為了確定自噬對ox-LDL誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響，將實驗分為4組:(1)對照組，培養(yǎng)液培養(yǎng)，作為對照;(2)ox-LDL刺激組(80μg/ml);(3)3-MA組(5mmol/L)，(4)3-MA(5mmol/L)+ox-LDL(80μg/ml)。Western-Blot檢測ox-LDL和3-MA作用后的LC3的表達變化，ELISA檢測TNF-α、

11、IL-1和IL-6表達的變化。
　　結(jié)果:
　　1.ox-LDL作用于THP1細胞后，可以使LC3的表達明顯增高，并且LCⅠ被剪切成LC3Ⅱ的數(shù)量明顯增多，免疫熒光顯示LC3在細胞內(nèi)的聚集明顯增多，細胞內(nèi)出現(xiàn)典型的點狀熒光，這就說明ox-LDL引起了細胞內(nèi)自噬泡的形成。
　　2.流式結(jié)果顯示，ox-LDL作用于THP1細胞后，細胞內(nèi)MDC的熒光明顯增強。同時在熒光顯微鏡下觀察顯示，ox-LDL作用于THP1細胞后，細胞

12、中被MDC染色的酸性囊泡明顯增多，這些結(jié)果進一步表明ox-LDL可以誘導(dǎo)THP1細胞產(chǎn)生自噬。
　　3.Western結(jié)果顯示，加入3-MA后，可以使ox-LDL誘導(dǎo)的LCⅡ的表達下降，說明3-MA可以抑制ox-LDL誘導(dǎo)的自噬;ELISA結(jié)果顯示ox-LDL可以使THP1細胞中的TNF-α、IL-1和IL-6的表達增高，抑制自噬后，ox-LDL誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1和IL-6的表達會進一步升高。
　　結(jié)論: