Pannexin1對LXR介導(dǎo)的巨噬細胞吞噬ox-LDL的影響及分子機制的初探.pdf

1、動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種由多種因素誘導(dǎo)的血管慢性炎癥疾病，在AS發(fā)生過程中，巨噬細胞吞噬脂質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽毎?，泡沫細胞堆積形成脂質(zhì)條紋，最后發(fā)展形成脂質(zhì)斑塊。斑塊破裂后形成血栓堵塞血管，導(dǎo)致缺血性中風(fēng)或心肌梗死，嚴重威脅人類健康。AS的發(fā)生發(fā)展過程中，脂質(zhì)代謝紊亂是重要的環(huán)節(jié)。肝X受體（Liver X Receptor，LXR）激活后可誘導(dǎo)細胞釋放腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphospha

2、te，ATP），且明顯減少AS斑塊的形成。但詳細的分子機制尚不明確。Pannexin1是六聚體形成的膜通道蛋白，其開放后可允許小分子通過，ATP即可經(jīng)由該通道釋放。但Pannexin1通道是否參與巨噬細胞吞噬脂質(zhì)，從而進一步轉(zhuǎn)化為泡沫細胞未見報道。本研究檢測了 Pannexin1通道對 LXR介導(dǎo) THP-1巨噬細胞攝取氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）作用，并初步對其分

3、子機制進行了探討。該研究為深入研究AS發(fā)生發(fā)展機制提供了新的思路。
　　方法：
　　1.采用佛波酯（Phorbol12-myristate13-acetate，PMA）誘導(dǎo)人急性白血病單核細胞（THP-1）分化成為THP-1巨噬細胞，并經(jīng)細胞形態(tài)學(xué)及CD14 mRNA的表達的檢測對細胞分化是否成功進行鑒定。
　　2.采用RT-PCR檢測THP-1巨噬細胞中Pannexin1的mRNA的表達。
　　3.采用West

4、ern Blot技術(shù)檢測LXR激動劑（GW3965）刺激前后THP-1巨噬細胞中LXRα和LXRβ的表達情況。
　　4.采用熒光顯微鏡觀察LXR激動劑（GW3965）介導(dǎo)THP-1巨噬細胞攝取Dil-ox-LDL。通過加入Pannexin1通道抑制劑（10Panx1）前后觀察LXR激動劑（GW3965）介導(dǎo)THP-1巨噬細胞攝取Dil-ox-LDL的變化，使用圖像分析軟件（Image-pro plus v6.0）對熒光圖片進行分析

5、，計算出對應(yīng)的細胞數(shù)，用以衡量細胞攝取Dil-ox-LDL量的變化情況。
　　5.采用螢光素酶法以及 RT-PCR技術(shù)檢測應(yīng)用Pannexin1通道抑制劑（10Panx1）前后GW3965刺激細胞釋放ATP的變化情況以及ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1（ATP-Binding Cassette Transporters A1，ABCA1）的表達。
　　結(jié)果：
　　1.THP-1細胞經(jīng)160nM PMA誘導(dǎo)分化24小時后，細胞形態(tài)

6、由分化前的圓形懸浮生長變?yōu)樗笮?，并有大量的偽足出現(xiàn)，且呈貼壁生長。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，THP-1經(jīng)誘導(dǎo)分化為 THP-1巨噬細胞后，THP-1巨噬細胞中CD14 mRNA表達水平明顯上調(diào)，與THP-1細胞誘導(dǎo)前相比有顯著性差異（p<0.001）。
　　2.Western Blot檢測顯示LXR激動劑（GW3965）可以明顯誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞LXRα和LXRβ的表達。使用GW3965處理THP-1巨噬細胞前后差異有統(tǒng)計學(xué)意

7、義（p<0.001）。
　　3.THP-1巨噬細胞攝取Dil-ox-LDL結(jié)果顯示：以Pannexin1通道抑制劑10Panx1（200μM）預(yù)處理細胞30分鐘，再用GW3965刺激THP-1巨噬細胞4小時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制劑組可以減弱細胞對Dil-ox-LDL的攝取，與GW3965刺激組相比有顯著性差異（p<0.01）。
　　4.THP-1巨噬細胞經(jīng) GW3965刺激不同時間（0min、5min、10min、20min、30m

8、in）后，GW3965刺激組各時間點細胞釋放的ATP含量較對照組顯著增加（p<0.001），并且 GW3965刺激10分鐘時達到高峰；當(dāng)使用200μM的Pannexin1通道特異性抑制（10Panx1）預(yù)處理細胞30分鐘，檢測結(jié)果顯示 ATP的釋放量較 GW3965刺激組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）。
　　5.RT-PCR檢測顯示LXR激動劑（GW3965）可以誘導(dǎo)ABCA1的表達，當(dāng)使用200μM的Pannexin

9、1通道特異性抑制劑（10Panx1）預(yù)處理細胞30分鐘，可明顯地抑制 GW3965誘導(dǎo) ABCA1的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.Pannexin1通道抑制劑（10Panx1）可抑制LXR激動劑（GW3965）介導(dǎo)的THP-1巨噬細胞釋放ATP的過程。
　　2.Pannexin1通道抑制劑（10Panx1）對LXR激動劑（GW3965）誘導(dǎo)巨噬細胞攝取ox-LDL的能力起到抑制作用。