TRPM2通過調(diào)控巨噬細胞吞噬體成熟介導(dǎo)殺菌及機制研究.pdf

1、第一部分 TRPM2在膿毒癥巨噬細胞清除細菌中的作用
　　研究目的:TRPM2是一種非選擇性Ca2+通透性陽離子通道。近年來研究發(fā)現(xiàn)TRPM2通道激活后在潰瘍性結(jié)腸炎、心肌缺血再灌注損傷、神經(jīng)病理性疼痛、自發(fā)性腦脊髓炎等疾病中發(fā)揮重要作用，因此TRPM2具有調(diào)控細胞因子產(chǎn)生、胰島素釋放、細胞活力、凋亡等多樣的功能。而TRPM2調(diào)控巨噬細胞防御病原體入侵的先天免疫防御機制尚不十分清楚，因此本部分研究首先探討了TRPM2對腹腔感染大腸

2、桿菌(E.coli)膿毒癥模型預(yù)后的影響以及巨噬細胞TRPM2對細菌清除的作用。
　　研究方法:采用腹腔感染E.coli膿毒癥模型，觀察野生型小鼠(WT)和TRPM2基因敲除小鼠（Trpm2-/-）膿毒癥的72h生存率。模型后的2h、6h、12h取腹腔灌洗液，用瓊脂平板法檢測腹腔細菌負荷。離體培養(yǎng)野生型和TRPM2基因缺陷型腹腔巨噬細胞，觀察巨噬細胞的細菌吞噬能力及細菌清除能力。分離培養(yǎng)1個對照和3個膿毒癥患者外周血單核巨噬細胞，

3、檢測TRPM2 mRNA的表達，同時，觀察單核巨噬細胞對細菌的清除能力。
　　研究結(jié)果:腹腔感染E.coli模型后，Trpm2-/-小鼠72h生存率較WT小鼠明顯降低。Trpm2-/-小鼠2h、6h、12h腹腔灌洗液細菌負荷較WT小鼠明顯增高。離體培養(yǎng)野生型和TRPM2基因缺陷型腹腔巨噬細胞，兩組細胞對E.coli的吞噬能力并沒有明顯改變，而2h和6h后TRPM2基因缺陷型腹腔巨噬細胞對E.coli的清除能力明顯低于WT型細胞。分

4、離培養(yǎng)1個對照和3個膿毒癥患者外周血單核巨噬細胞，檢測TRPM2 mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者外周血單核巨噬細胞中TRPM2表達越高，細胞對細菌的清除能力越強，反之，TRPM2表達最低的細胞，對細菌的清除能力最弱。
　　研究結(jié)論:TRPM2缺陷不利于巨噬細胞對E.coli的清除，增加膿毒癥的死亡率。
　　第二部分 TRPM2影響巨噬細胞殺菌活性的機制研究
　　研究目的:第一部分研究發(fā)現(xiàn)TRPM2通過調(diào)控巨噬細胞細菌清

5、除能力，從而在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中起到保護作用。因此，本部分研究通過觀察巨噬細胞吞噬細菌后細胞內(nèi)吞噬體的動態(tài)變化特征，探討TRPM2參與巨噬細胞殺菌過程的分子機制。
　　研究方法:pHrodo偶聯(lián)的E.coli刺激WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬細胞并于刺激后20min、40min、60min、80min及100min后檢測吞噬體內(nèi)的pH值。對WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬細胞進行吖啶橙染色，觀察兩組巨噬細胞內(nèi)溶酶體的酸性。E.coli刺激

6、WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬細胞后，觀察刺激前后兩組巨噬細胞內(nèi)溶酶體內(nèi)的水解酶cathepsin D(CTSD)的成熟情況。熒光E.coli刺激WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬細胞后進行LysoTracker Red DND-99染色，觀察刺激后兩組巨噬細胞內(nèi)含E.coli吞噬體的酸化及融合情況。熒光E.coli刺激WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬細胞后，觀察E.coli與溶酶體膜標記物L(fēng)AMP-1的共定位情況。采用超速離心技術(shù)分離到WT及TR

7、PM2缺陷腹腔巨噬細胞吞噬體，通過免疫熒光和western blot兩種方法觀察吞噬體上LAMP-1、CTSD、Rab7的表達情況。通過免疫熒光動態(tài)觀察WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬細胞吞噬體上Rab5和EEA-1的變化特點。E.coli刺激WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬細胞后，免疫共沉淀方法觀察Rab5和EEA-1的相互作用。
　　研究結(jié)果:pHrodo偶聯(lián)的E.coli刺激WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬細胞，刺激后20min和40m

8、in，兩組細胞吞噬體內(nèi)的pH值變化不大;60min時，盡管兩組細胞吞噬體pH值變化無統(tǒng)計學(xué)意義，但是WT型細胞吞噬體內(nèi)酸化程度高于TRPM2缺陷巨噬細胞;80min和100min時，WT型細胞吞噬體明顯酸化，而TRPM2缺陷細胞吞噬體酸化程度明顯緩慢。吖啶橙染色顯示，兩組巨噬細胞溶酶體的酸性并沒有明顯變化。E.coli刺激WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬細胞后(0min、30min、60min、120min)，兩組細胞溶酶體內(nèi)的成熟CTSD

9、無明顯變化。LysoTracker Red DND-99染色顯示，兩組巨噬細胞溶酶體的酸性并沒有明顯變化，而E.coli刺激120min后，TRPM2缺陷細胞內(nèi)包繞在E.coli吞噬體周圍的酸性溶酶體較WT型細胞明顯減少。熒光E.coli刺激WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬細胞120min后， TRPM2缺陷細胞LAMP-1陽性吞噬體數(shù)量明顯低于WT型細胞。采用超速離心技術(shù)分離到WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬細胞吞噬體，結(jié)果發(fā)現(xiàn):微球刺激12

10、0min后，TRPM2缺陷細胞吞噬體上LAMP-1的熒光強度明顯低于WT型吞噬體，TRPM2缺陷細胞吞噬體上Rab7的熒光強度也明顯低于WT型吞噬體;微球刺激60和120min后，TRPM2缺陷細胞吞噬體上LAMP-1的蛋白表達明顯低于WT型吞噬體，TRPM2缺陷細胞吞噬體上CTSD的蛋白表達明顯低于WT型吞噬體，TRPM2缺陷細胞吞噬體上Rab7的蛋白表達也明顯低于WT型吞噬體。通過免疫熒光動態(tài)觀察WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬細胞吞噬

11、體上Rab5和EEA-1的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在吞噬體成熟的過程中，野生型巨噬細胞吞噬體上Rab5的表達逐漸減少，同時Rab5的栓系分子EEA-1的表達也逐漸減少;相反地，TRPM2缺陷型巨噬細胞吞噬體上Rab5的表達并沒有隨著吞噬體的成熟過程而表達減少，同時EEA-1始終低表達。E.coli刺激WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬細胞30min后，TRPM2缺陷腹腔巨噬細胞內(nèi)Rab5與EEA-1的相互作用較WT型細胞明顯降低。
　　研究結(jié)論

12、:TRPM2缺陷并不直接影響巨噬細胞溶酶體的酸化和成熟，而是阻礙吞噬體與溶酶體的融合;TRPM2缺陷通過降低Rab5與EEA-1的相互作用減少吞噬體的成熟。以上結(jié)論反映了TRPM2缺陷可能通過阻礙巨噬細胞吞噬體成熟影響吞噬體與溶酶體的融合。
　　第三部分 TRPM2調(diào)控巨噬細胞胞內(nèi)鈣離子濃度在吞噬體-溶酶體融合中的作用
　　研究目的:綜合前兩部份的研究結(jié)果，TRPM2缺陷降低吞噬體成熟、阻礙腹腔巨噬細胞對細菌的清除、增加腹腔

13、細菌負荷，從而加重膿毒癥的預(yù)后。為了深入探討TRPM2做為靶標進行干預(yù)的效果，我們采用離子霉素來調(diào)節(jié)TRPM2缺陷引起的巨噬細胞內(nèi)[Ca2+]i減少，觀察TRPM2調(diào)控的[Ca2+]i的改變對巨噬細胞吞噬體-溶酶體融合以及膿毒癥預(yù)后的影響。
　　研究方法:對照溶劑或者2μM壓離子霉素處理TRPM2缺陷腹腔巨噬細胞5min，觀察細胞內(nèi)Ca2+信號。包被有細菌外膜粗提物的微球刺激WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬細胞60min后，對照溶劑或

14、者離子霉素處理5min，再放置55min，然后采用超速離心技術(shù)分離得到巨噬細胞吞噬體，通過免疫熒光法和免疫印跡觀察吞噬體上LAMP-1的表達情況。對照溶劑或者離子霉素處理WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬細胞5min后，E.coli刺激細胞30min，免疫共沉淀方法觀察Rab5和EEA-1的相互作用。WT及TRPM2缺陷腹腔巨噬細胞吞噬E.coli lh，對照溶劑或者離子霉素處理5min后，慶大霉素實驗觀察巨噬細胞的細菌清除能力。對照溶劑或者

15、離子霉素處理巨噬細胞5min后，分別回輸?shù)絋rpm2-/-小鼠體內(nèi)（5×105/只），觀察E.coli腹腔感染模型的生存率和細菌負荷。
　　研究結(jié)果:對照溶劑或者2μM離子霉素處理TRPM2缺陷腹腔巨噬細胞后，離子霉素處理組細胞內(nèi)的Ca2+信號強度明顯增高。離子霉素處理的TRPM2缺陷巨噬細胞組吞噬體上LAMP-1的熒光表達強度及蛋白表達較對照溶劑處理的TRPM2缺陷巨噬細胞組明顯增強，離子霉素處理組的LAMP-1的熒光表達強度和

16、WT型巨噬細胞組無明顯差異。E.coli刺激后，和對照溶劑處理的TRPM2缺陷巨噬細胞組相比，離子霉素處理的TRPM2缺陷巨噬細胞組的Rab5和EEA-1的相互作用明顯增強。和對照溶劑處理的TRPM2缺陷巨噬細胞組相比，離子霉素處理的TRPM2缺陷巨噬細胞組2h和6h的細菌負荷明顯降低。和對照溶劑處理的TRPM2缺陷巨噬細胞回輸Trpm2-/-小鼠體內(nèi)相比，離子霉素處理的TRPM2缺陷巨噬細胞回輸明顯增加E.coli腹腔感染模型的生存率

17、，降低腹腔細菌負荷。
　　研究結(jié)論:離子霉素處理提高TRPM2缺陷巨噬細胞內(nèi)的[Ca2+]i能夠促進吞噬體和溶酶體融合;提高細胞內(nèi)的Ca2+濃度能夠提高巨噬細胞內(nèi)Rab5和EEA-1的相互作用;提高細胞內(nèi)的Ca2+濃度能夠增加巨噬細胞的細菌清除能力;離子霉素處理的TRPM2缺陷巨噬細胞回輸能夠提高E.coli腹腔感染模型的生存率，降低腹腔細菌負荷。以上結(jié)論反映了TRPM2通過調(diào)控細胞內(nèi)的Ca2+濃度影響Rab5和EEA1的相互作用