雌二醇對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 動(dòng)脈粥樣硬化是一種與血脂異常及血管壁成分改變有關(guān)的動(dòng)脈疾病。脂質(zhì)在動(dòng)脈血管內(nèi)膜的沉積，引起內(nèi)膜纖維增厚及其深部成分的壞死，崩解，形成粥樣物。
　　 由于成年女性隨著年齡的增加，雌激素的水平逐漸降低，而絕經(jīng)前女性動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病總體發(fā)病率較絕經(jīng)后婦女低。因此長(zhǎng)期以來傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為：雌激素起動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)作用,這一點(diǎn)也得到許多整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的支持,并且認(rèn)為其保護(hù)作用機(jī)制包括脂代謝途徑（如降低LDL，

2、升高HDL）和非脂代謝途徑（如穩(wěn)定粥樣斑塊）。然而臨床研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后婦女雌激素替代療法卻能夠增加心肌梗死，卒中，靜脈血栓，乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)。進(jìn)一步研究表明：雖然絕經(jīng)前期、絕經(jīng)期、或絕經(jīng)后早期補(bǔ)充雌激素有利于降低動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但是絕經(jīng)后晚期補(bǔ)充雌激素卻使得動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加，目前對(duì)雌激素在不同年齡階段顯示出的雙向性作用還沒有很好的解釋。
　　 動(dòng)脈粥樣硬化始動(dòng)因素是由于巨噬細(xì)胞吞入修飾的低密度

3、脂蛋白,脂質(zhì)斑塊在大動(dòng)脈壁聚積。各種危險(xiǎn)因素可以損傷內(nèi)皮細(xì)胞，單核細(xì)胞通過細(xì)胞黏附因子（VCAM，ICAM，selectins等）與內(nèi)皮細(xì)胞黏附并向內(nèi)皮下遷移。在內(nèi)皮下，單核細(xì)胞在巨噬細(xì)胞集落刺激因子（MCSF）的作用下分化成巨噬細(xì)胞，通過清道夫受體（SR-A和CD36等）吞噬氧化性低密度脂蛋白(Ox-LDL)逐漸形成泡沫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的起始和發(fā)展中起關(guān)鍵性的作用。
　　 動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程實(shí)際上可以看作是

4、巨噬細(xì)胞對(duì)“內(nèi)源性異物（Ox-LDL）”的清除反應(yīng)，單核細(xì)胞的黏附、遷移、分化、吞噬及泡沫細(xì)胞的形成則是該過程的關(guān)鍵：由單核/巨噬細(xì)胞iNOS所產(chǎn)生的大量NO,可以引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化LDL為Ox-LDL或硝基LDL（NO2-LDL）,Ox-LDL通過MAPK的磷酸化作用調(diào)節(jié)PPARγ的活性，上調(diào)清道夫受體CD36表達(dá)，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬Ox-LDL，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成；同時(shí)，Ox-LDL也可直接引起JNK磷酸化，從而促進(jìn)另一個(gè)清道夫

5、受體SR-A磷酸化，并使之表達(dá)增加，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬Ox-LDL，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成；iNOS還可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，另外,NO通過不同的機(jī)制調(diào)節(jié)IL-8和TNF-a的生成,巨噬細(xì)胞在TNF-α、IL-1的誘導(dǎo)下，巨噬細(xì)胞可釋放金屬蛋白酶（MMP）蛋白，金屬蛋白酶能特異性地與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分相結(jié)合并降解，減弱新生血管形成增加了斑塊的不穩(wěn)定性，促進(jìn)斑塊破裂和血栓形成?？梢?單核/巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展的炎癥反應(yīng)過程中起著

6、非常重要的作用，其已經(jīng)成為新的非常重要的治療動(dòng)脈粥樣硬化的靶點(diǎn)。
　　 研究表明，在人和鼠iNOS基因存在雌激素受體反應(yīng)元件（vitellogenin ERE，AGGTCAnnnTGACCT）,雌激素能促進(jìn)巨噬細(xì)胞致炎因子iNOS表達(dá)，激活巨噬細(xì)胞，此外，雌激素還能促進(jìn)TNF-α表達(dá)，促進(jìn)NO的生成，故而雌激素其實(shí)是促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生的。因此，絕經(jīng)后晚期婦女補(bǔ)充雌激素，由于雌激素的促炎效應(yīng)，結(jié)果造成動(dòng)脈粥樣斑塊不穩(wěn)定，誘發(fā)血管急性

7、事件，最終造成動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加。然而單一的量效關(guān)系與“在絕經(jīng)前、絕經(jīng)期和絕經(jīng)后早期，雌激素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用”的現(xiàn)象相矛盾；也會(huì)與臨床現(xiàn)象“雖然隨年齡的增加，女性患動(dòng)脈粥樣硬化的總患病率會(huì)增加，但是在絕經(jīng)期患病風(fēng)險(xiǎn)大大增加，而在55-60歲左右心血管疾病事件的發(fā)生率呈指數(shù)增加”相矛盾。
　　 為解釋這矛盾現(xiàn)象，本研究擬以誘導(dǎo)鼠源單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞RAW264. 7為靶細(xì)胞，通過建立Ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞源

8、泡沫細(xì)胞模型，給予不同劑量的雌二醇干預(yù)，觀察雌二醇（E2）對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響，并研究其可能的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 鼠源單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞RAW264. 7細(xì)胞培養(yǎng)，分為未經(jīng)Ox-LDL誘導(dǎo)組和經(jīng)75 mg/L ox-LDL誘導(dǎo)12小時(shí)的誘導(dǎo)組。其中Ox-LDL誘導(dǎo)組又分為空白對(duì)照組，DMSO組（溶劑對(duì)照），1 pmol/L E2組，25 pmol/L E2組，50 pmol/L E2組

9、，100 pmol/L E2組，油紅染色觀察巨噬細(xì)胞對(duì)Ox-LDL的吞噬情況,半定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）測(cè)定巨噬細(xì)胞清道夫受體CD36，SR-BI精氨酸酶Ⅰ(ARG1)，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表達(dá)，硝基還原酶法測(cè)定NO的含量結(jié)果與未經(jīng)Ox-LDL誘導(dǎo)組相比較，經(jīng)Ox-LDL誘導(dǎo)的空白對(duì)照組的巨噬細(xì)胞對(duì)脂滴的吞噬明顯增加，CD36、SR-BI、iNOS、ARG1 mRNA的表達(dá)明顯增加，細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的

10、含量明顯增加（P<0.05）；經(jīng)ox-LDL誘導(dǎo)DMSO組，l pmol/L E2組與空白對(duì)照組比較，巨噬細(xì)胞對(duì)脂滴的吞噬、CD36、SR-BI、iNOS、ARG1 mRNA的表達(dá)、細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的含量的影響均無顯著性差異，然而，經(jīng)ox-LDL誘導(dǎo)組中的25 pmol/L，50 pmol/L，100 pmol/L E2組巨噬細(xì)胞對(duì)脂滴的吞噬較經(jīng)ox-LDL誘導(dǎo)DMSO組均明顯增加，CD36mRNA表達(dá)顯著性增加，iNOS mRNA的表

11、達(dá)顯著性增加，ARG1 mRNA的表達(dá)顯著性減少，細(xì)胞培養(yǎng)液NO的含量顯著性增加（P<0.05），且呈逆濃度變化趨勢(shì)。而SR-BI mRNA的表達(dá)無顯著性差異。E2（1～100 pmol/L）能促進(jìn)小鼠源單核巨噬細(xì)胞RAW264. 7對(duì)Ox-LDL的吞噬，促進(jìn)CD36 mRNA的表達(dá)，并促進(jìn)iNOS mRNA表達(dá)和NO的生成，作用呈現(xiàn)“拋物線”變化趨勢(shì)，最大效應(yīng)在25 pmol/L 附近。
　　 結(jié)論：
　　 E2（1～