抗MBL單抗1C8對人單核巨噬細胞調(diào)理吞噬功能的影響及其機制.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-binding lectin,MBL)作為人體天然免疫系統(tǒng)中重要的模式識別受體,近年來一直是天然免疫研究的熱點之一。MBL是由肝細胞分泌的膠原樣復(fù)合血漿蛋白,為C型凝集素家族成員[1]。成熟的MBL肽鏈自N端至C端依次為富含半胱氨酸(Cys)的N末端區(qū)、膠原樣區(qū)(collagen-likeregion,CLR)、α螺旋構(gòu)成的頸區(qū)和C端的糖識別域(carbohydrate recognitiondomai

2、n,CRD)[2]。MBL在機體天然免疫中有重要的抗感染作用,它利用CRD識別廣泛分布于多種病原體如細菌、真菌、病毒和寄生蟲等表面的糖蛋白或糖結(jié)構(gòu),例如D-甘露聚糖、鹽藻糖、N-乙酰甘露糖胺和N-乙酰葡萄糖胺等。其CLR與甘露聚糖相關(guān)絲氨酸蛋白酶(mannan-binding lectin associated serineprotease,MASP1、MASP2、MASP3)結(jié)合形成MBL-MASPs復(fù)合物,激活補體介導(dǎo)的凝集素途徑而

3、發(fā)揮調(diào)理功能;或者與吞噬細胞膠凝素受體(ClqR)結(jié)合,以不依賴于補體的方式啟動調(diào)理吞噬[1]。此外,球形結(jié)構(gòu)的CRD與某些病毒(如流感病毒A)結(jié)合后可直接中和病毒活性[3,4]。血漿中的MBL是二至六聚體的混合物[5,6],只有三聚體及以上的高聚體MBL才能有效識別病原體表面的糖結(jié)構(gòu),進而激活補體[7]。
   MBL在人血清中的含量很低,正常人平均含量為1mg/L。MBL亦是一種急性期反應(yīng)蛋白,在應(yīng)激狀態(tài)下(如外科手術(shù)、病原

4、體感染、腫瘤等),其血漿濃度可升高2~3倍。MBL缺損患者處于高度的感染風(fēng)險之中,表現(xiàn)為多種病原體的反復(fù)急慢性感染,然而MBL水平過高,可能會通過凝集素途徑而過度活化補體,導(dǎo)致機體的炎癥性損傷[1,8,9]。有文獻報道,高MBL水平與缺血-再灌注損傷的炎癥反應(yīng)、糖尿病腎臟并發(fā)癥及原發(fā)性膽汁性淤積型肝硬化有關(guān)[10,11,12]。相反,MBL水平低下,其激活補體的能力相對下降,則降低了炎癥介質(zhì)對宿主細胞的損傷。此外,高水平MBL可能會促進

5、吞噬細胞(如單核巨噬細胞、中性粒細胞等)對胞內(nèi)寄生菌的攝取,如結(jié)核分枝桿菌和利什曼原蟲等,增加了病原體入侵的機會[13],因此正常水平的MBL對機體尤為重要。眾所周知,單核巨噬細胞在天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,并參與特異性免疫應(yīng)答。正常情況下單核巨噬細胞通過吞噬異物、細菌、衰老和突變的細胞以及天然的免疫復(fù)合物維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)[14]。據(jù)文獻報道,富含MBL的人血清能促進吞噬細胞的調(diào)理吞噬功能[15,16]。
   鑒于上述MB

6、L的重要作用和商品化抗MBL抗體的昂貴價格,本科室制備了一系列抗MBL單克隆抗體,并從中篩選了一株功能性單抗1C8。有研究表明,MBL能增強補體的活化和促進吞噬細胞吞噬病原體,但是抗MBL單抗對單核巨噬細胞調(diào)理吞噬的作用目前尚未見報道,故本課題組以單核巨噬細胞為切入點,初步探索1C8對單核巨噬細胞調(diào)理吞噬功能的影響及其作用機制。我們首先鑒定了抗MBL抗體1C8的純度和生物學(xué)活性,它能與本科室提取的天然有活性的MBL和商品MBL以劑量依賴

7、的形式結(jié)合,并初步探討了1C8對混合人血清刺激的單核巨噬細胞調(diào)理吞噬功能的影響及其作用機制。
   第一章抗MBL單克隆抗體1C8的純化和鑒定
   隨著對MBL研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)其除了能識別并清除病原體之外,還有許多內(nèi)源性功能(endogenous function),例如識別缺血-再灌注損傷中暴露的自身抗原、參與吞噬凋亡細胞、結(jié)合腫瘤細胞并發(fā)揮MBL介導(dǎo)的細胞毒作用等,但是抗MBL抗體有關(guān)的報道甚少。目前市場上已經(jīng)

8、有商品的抗MBL單克隆抗體,但是因為其價格昂貴,令人望而卻步,而且其針對的是真核表達的商品MBL,而不是天然純化的MBL。本課題組多年以來一直致力于天然MBL的純化和相關(guān)功能的研究,尤其是純化分離MBL的技術(shù)已經(jīng)成熟。鑒于此,本科室制備了以天然純化的MBL為抗原的單克隆抗體(1C8等)。本部分工作主要是鑒定1C8的純度和生物學(xué)活性。
   首先復(fù)蘇本科室已經(jīng)制備并保存在液氮的雜交瘤細胞株1C8,然后制備單克隆抗體腹水,經(jīng)辛酸-硫

9、酸銨沉淀法(CA-AS)純化腹水中的單克隆抗體,進一步我們分別運用SDS-PAGE和Western-blot鑒定了1C8的純度與特異性,并通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbence assay,ELISA)同商品化的抗MBL抗體HYB131-11做了比較,檢測了1C8的敏感性。根據(jù)檢測結(jié)果分析,1C8不僅能與本科室自提天然有活性的MBL結(jié)合良好,亦能與商品MBL結(jié)合,而且同商品化的抗MBL抗體HYB1

10、31-11沒有顯著區(qū)別。以上結(jié)果表明1C8有良好的結(jié)合MBL的生物學(xué)活性,為1C8的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。
   第二章1C8對人單核巨噬細胞調(diào)理吞噬功能的影響
   有研究表明,富含MBL的人血清能促進吞噬細胞的調(diào)理吞噬和增強補體的活化,但是凝集素途徑過強則會導(dǎo)致炎癥性損傷。單核巨噬細胞作為專職的抗原遞呈細胞,它通過吞噬衰老的細胞和病原體等維持機體的穩(wěn)態(tài)。本部分工作主要是分離和培養(yǎng)人單核巨噬細胞,旨在探討1C8對含MBL

11、的混合人血清誘導(dǎo)的單核巨噬細胞調(diào)理吞噬功能的影響。
   無菌分離人外周血單個核細胞(peripheral blood monoeuclear cell,PBMC),用流式細胞術(shù)(flow cytometry,F(xiàn)CM)分析時,將1C8/IgG、10%滅活/未滅活混合人血清和FITC-白色念珠菌預(yù)先孵育30min后加入到PBMC中,37℃搖床孵育30min,然后檢測1C8對CD14+的單核細胞吞噬FITC-白色念珠菌的影響。在用熒

12、光顯微鏡觀察1C8對巨噬細胞吞噬功能的影響時,預(yù)先將PBMC貼壁2h,待貼壁細胞形態(tài)良好時加入50ng/ml的M-CSF,培養(yǎng)9d。FCM結(jié)果顯示,1C8能抑制混合人血清誘導(dǎo)的單核細胞吞噬FITC-白色念珠菌,而且能降低到無補體的滅活血清水平。在熒光顯微鏡下觀察1C8對巨噬細胞吞噬FITC-白色念珠菌的影響與FCM的結(jié)果一致,表現(xiàn)為1C8組的巨噬細胞吞噬FITC-白色念珠菌的數(shù)目減少。以上結(jié)果為1C8直接調(diào)節(jié)MBL介導(dǎo)的凝集素途徑提供了

13、實驗依據(jù)。尚需要進一步解決的問題是:1C8與MBL結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的初步確定;1C8對其他免疫細胞的調(diào)節(jié)作用等。
   第三章1C8對人單核巨噬細胞調(diào)節(jié)作用的機制初探
   為了初步探討1C8對單核巨噬細胞調(diào)節(jié)功能的作用機制,首先我們重組表達了人MBL-CRD蛋白(recombinant human MBL-CRD,rhMBL-CRD),并對其進行了SDS-PAGE和Western-blot鑒定。采用ELISA研究1C8與r

14、hMBL-CRD、MASP-1C、MASP-2C和MASP-2N蛋白的結(jié)合,并用SDS-PAGE和Western-blot鑒定1C8與rhMBL-CRD、rhMBL-CLR結(jié)合的特異性。用直接ELISA分析甘露聚糖(mannan)、甘露糖(mannose)、D-半乳糖、D-半乳糖胺、D-甘露糖胺和D-葡萄糖胺對HRP-1C8結(jié)合rhMBL-CRD的影響。并用凝集實驗觀察1C8對rhMBL-CRD結(jié)合FITC-大腸桿菌及FITC-白色念珠

15、菌的影響。rhMBL-CRD的Western-blot結(jié)果提示,rhMBL-CRD能與本科室制備的抗MBL-CRD單克隆抗體結(jié)合良好,在43KD處有明顯條帶。ELISA結(jié)果顯示1C8能以劑量依賴的方式結(jié)合rhMBL-CRD,但不與MASP-1C、MASP-2C和MASP-2N蛋白結(jié)合,同Western-blot的結(jié)果一致。直接ELISA的結(jié)果表明,1C8與rhMBL-CRD的結(jié)合能被上述六種糖所阻斷,隨著糖濃度的降低,1C8與rhMBL

16、-CRD的結(jié)合增強。在熒光顯微鏡下觀察FITC-大腸桿菌及FITC-白色念珠菌的凝集,發(fā)現(xiàn)1C8能阻斷FITC-大腸桿菌及FITC-白色念珠菌與rhMBL-CRD的結(jié)合,而作為1C8對照的IgG組則沒有區(qū)別。以上結(jié)果提示1C8通過CRD結(jié)合MBL,并通過與病原體表面的糖結(jié)構(gòu)競爭結(jié)合CRD而阻斷MBL介導(dǎo)的凝集素途徑。
   綜上,本研究發(fā)現(xiàn),抗MBL單克隆抗體1C8可與本科室自提天然有活性的MBL及商品MBL結(jié)合,而且與商品化的

17、抗MBL抗體HYB131-11沒有區(qū)別。通過檢測1C8對混合人血清刺激的單核巨噬細胞調(diào)理吞噬功能的影響及1C8與MBL結(jié)合部位的確定,初步獲得了1C8應(yīng)用價值的證據(jù)。但是1C8對MBL誘導(dǎo)的單核巨噬細胞增殖和分泌細胞因子的調(diào)節(jié)作用,以及對其它免疫細胞的影響均需要進一步的研究。下一步工作將繼續(xù)探索1C8對單核巨噬細胞分泌炎性細胞因子和凋亡的影響,并進一步研究1C8對T細胞、NK細胞等的調(diào)節(jié)作用。本研究將為1C8的后續(xù)應(yīng)用提供實驗依據(jù),并為

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