血清高密度脂蛋白1對人單核源性巨噬細胞泡沫化的影響.pdf

1、研究背景：
　　 已證實血清高密度脂蛋白(HDL)具有抗動脈粥樣硬化(AS)及心臟保護的作用。HDL由多種具有不同顆粒特性與生理功能的亞類組成，不同亞類在HDL抗AS的總體效應(yīng)中發(fā)揮不同的作用，對防治冠心病(CHD)有重要意義。但是，目前國內(nèi)外對HDL亞類的組成和顆粒特性仍不甚清楚，臨床還不能通過HDL亞類調(diào)節(jié)RCT而獲得明顯的治療效果。由于HDL組成具有復(fù)雜的不均一性，同時由于其顆粒結(jié)構(gòu)特殊，因而如何通過檢測HDL亞類來分析膽

2、固醇逆向轉(zhuǎn)運(RCT)的狀態(tài)，以及對HDL亞類尤其是其新類型的理化結(jié)構(gòu)和生理功能進行深入探討，是目前研究的熱點與難點。在我們的前期研究中，通過分段濃度聚丙烯酰胺凝膠電泳(sd-PAGE)的新方法，將SBB預(yù)染血清同步分離出11～13條區(qū)帶，分別為2種游離脂肪酸(ALB-FFA1-2)、5種HDL亞組分(HDL1-5)、3種表現(xiàn)型的低密度脂蛋白(LDL)、中間密度脂蛋白(IDL)、2種極低密度脂蛋白(VLDL)，以及滯留于原點的乳糜微粒(

3、CM)。Sd-PAGE新方法不僅能將血清CM、VLDL、IDL、LDL及HDL等區(qū)分開來，而且可以對各組分作進一步的亞類分離，尤其突出的是HDL的5種亞類及其新類型(包括HDL5)。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)HDL1在所有sd-PAGE實驗的分離凝膠中均呈孤立分帶，表明它是一種相對獨立的新組分。這是一種新現(xiàn)象，對其進行深入研究具有重要的學(xué)術(shù)價值和臨床意義。
　　 目的：
　　 本實驗旨在采用M-PAGE新方法從血清中分離與制

4、取HDL的特殊亞類HDL1，從細胞水平觀察其對人外周血單核源性巨噬細胞泡沫化的影響，探討其在HDL抗動脈粥樣硬化中所發(fā)揮的作用，進而為從分子水平及受體水平對其進行深入研究提供線索。
　　 方法：
　　 1、低密度脂蛋白(LDL)的制備與氧化修飾：采用一次性密度梯度超速離心法從血漿中分離LDL，采用瓊脂糖凝膠電泳對其進行鑒定，改良Lowry法進行蛋白定量。以Cu2+誘導(dǎo)法對其進行氧化修飾，硫代巴比妥酸值(TBARS)法測定

5、其氧化程度。
　　 2、血清HDL1的分離和制備：首先用蘇丹黑B(SBB)將血清進行預(yù)染，采用分段濃度聚丙烯酰胺凝膠電泳(sd-PAGE)新方法同步分離血清LDL、HDL及其亞類等各種脂蛋白成分，采用自制洗脫、濃縮裝置定量制備血清HDL1。采用改良Lowry法對其進行蛋白定量，生化酶法和比濁法檢測HDL1溶液中apoA-I的含量。
　　 3、人外周血單核細胞的制備：采用密度梯度離心法和塑料吸附法從受試者外周血中分離出單核

6、細胞。以臺盼蘭拒染法和流式細胞技術(shù)檢測分離細胞的存活率與細胞純度。
　　 4、泡沫細胞模型的建立。
　　 4.1、單核細胞轉(zhuǎn)化為巨噬細胞：單核細胞以50nmol/L佛波酯(PMA)誘導(dǎo)48h，使之轉(zhuǎn)化為巨噬細胞。光鏡下進行形態(tài)學(xué)觀察。
　　 4.巨噬細胞轉(zhuǎn)化為泡沫細胞：將巨噬細胞與80mg/L氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)共孵育24h，使之轉(zhuǎn)化為泡沫細胞。采用油紅O染色后光鏡觀察、透射電鏡觀察，以及測定細胞內(nèi)

7、膽固醇含量和蛋白含量等方法對細胞模型進行形態(tài)學(xué)觀察與生物學(xué)鑒定。
　　 4.3、細胞存活率檢測：采用臺盼蘭拒染法測定實驗各階段中的細胞活性與細胞存活率，觀察不同濃度的HDL1，以及同一濃度的HDL1作用不同時間后對培養(yǎng)細胞是否存在毒性等不良作用。
　　 5、細胞內(nèi)膽固醇及蛋白含量的測定：采用膽固醇酯測定酶法測定細胞內(nèi)膽固醇含量，即分別采用總膽固醇(TC)與游離膽固醇(FC)含量酶法測定試劑盒測定細胞內(nèi)膽固醇含量，以TC減

8、去FC代表膽固醇酯(CE)的含量；采用改良Lowry法測定細胞內(nèi)蛋白質(zhì)(Pro)的含量，最后計算細胞內(nèi)CE/TC比值及TC/Pro比值。
　　 6、HDL1對巨噬細胞內(nèi)膽固醇和蛋白質(zhì)含量的影響：實驗細胞分為對照組與實驗組，其中對照組分別設(shè)空白對照(RPMI-1640組)、陽性對照(ox-LDL組)以及標(biāo)準(zhǔn)對照(apoA-I+ox-LDL組)三組，實驗組細胞首先以80 mg/Lox-LDL+不同濃度(0.1、1.0、10.0mg/

9、L)的HDL1干預(yù)24 h，采用膽固醇酯測定酶法測定細胞內(nèi)總膽固醇(TC)、游離膽固醇(FC)及膽固醇酯(CE)等指標(biāo)，確定HDL1降低細胞內(nèi)TC/Pro比值的最佳濃度，作出量效關(guān)系曲線；以HDL1的最佳濃度預(yù)處理巨噬細胞1 h后，加入80mg/Lox-LDL共孵育不同時間，即0、6、12、24 h。檢測相關(guān)指標(biāo)，確定HDL1降低細胞內(nèi)TC/Pro比值的最佳時間，作出時效關(guān)系曲線。
　　 7、統(tǒng)計學(xué)處理：實驗結(jié)果均采用Mean±

10、SD表示，組間差異進行單因素方差分析(ONE WAY ANOVA)后，再用LSD檢驗；方差不齊者采用非參數(shù)秩和檢驗。用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果
　　 1、血清脂蛋白的分離效果：通過sd-PAGE新方法將SBB預(yù)染血清同步分離出13條區(qū)帶，分別為2種游離脂肪酸(AL-FFA1-2)、5種HDL亞組分(HDL1-5，其中HDL1與HDL5為其新類型)、3種表現(xiàn)型的低密度脂

11、蛋白(LDL)、中間密度脂蛋白(IDL)、2種極低密度脂蛋白(VLDL)，以及滯留于原點的乳糜微粒(CM)。
　　 2、細胞模型的建立。
　　 2.1、單核細胞轉(zhuǎn)化為巨噬細胞：經(jīng)50nmol/LPMA誘導(dǎo)48h后光鏡下觀察大部分單核細胞已由圓形變成多角形狀，并易于聚集、貼壁，說明單核細胞已分化成為形態(tài)典型的巨噬細胞。
　　 2.2、巨噬細胞轉(zhuǎn)化為泡沫細胞：巨噬細胞與80mg/Lox-LDL共孵育24h后，油紅O染

12、色后光鏡觀察及透射電鏡觀測發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)存在大量的紅染脂質(zhì)顆粒與較多的脂質(zhì)空泡，膽固醇含量測定發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)CE/TC>60％，符合泡沫細胞的生物學(xué)定義。
　　 3、HDL1對巨噬細胞泡沫化的影響：經(jīng)不同濃度HDL1作用后，巨噬細胞內(nèi)TC/Pro比值隨HDL1濃度的增加而呈劑量依賴性降低(P<0.01)，巨噬細胞的泡沫化程度(CE/TC比值)也隨著HDL1濃度的升高而降低，且在濃度一定的情況下，細胞內(nèi)TC/Pro比值隨HDL1處理時間的

13、延長而呈時間依賴性降低(P<0.01)，與空白、陽性對照組相比，均有顯著性差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、Sd-PAGE電泳新方法不僅能將CM、VLDL、IDL、LDL及HDL等血清脂蛋白成分在分離凝膠中清晰地區(qū)分開來，而且可以對各組分作進一步的亞類分離，尤其突出的是HDL的5種亞類(其中HDL1、HDL5等為其新類型)。與既往分離血清脂蛋白亞組分的眾多方法相比，該法具有明顯的性能優(yōu)勢。
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