人單核—巨噬細(xì)胞分化與功能的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、巨噬細(xì)胞(Mψ)既可做為效應(yīng)細(xì)胞直接清除病原或腫瘤，又能遞呈抗原給T細(xì)胞并啟動(dòng)特異性免疫，在調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答過程中起著重要作用。Mψ具有異質(zhì)性，單核細(xì)胞在組織中能被環(huán)境因素誘導(dǎo)而分化成免疫活化或者抑制兩種完全不同的表型。Mψ的不同極化狀態(tài)與其能否發(fā)揮正常功能有關(guān)。當(dāng)機(jī)體被微生物感染時(shí)，Mψ細(xì)胞能否被有效活化與機(jī)體殺滅和清除入侵的微生物密切相關(guān)。Mψ也是腫瘤組織的重要成分，但是臨床和實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明大多數(shù)實(shí)體瘤中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor

2、-associatedmacrophages，TAMs)非但不能清除腫瘤，反而主動(dòng)抑制機(jī)體免疫應(yīng)答，在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移等過程中起了“幫兇”的作用。機(jī)體內(nèi)局部微環(huán)境是引起Mψ表型和功能改變的主要因素，但確切的機(jī)制目前尚不清楚。 本論文的研究主要利用一系列的細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法，同時(shí)結(jié)合生物信息學(xué)以及免疫學(xué)手段，以炎癥和腫瘤這兩個(gè)模型來研究調(diào)控Mψ分化和功能的機(jī)制。本論文的研究成果主要包括以下幾個(gè)方面： 1)感染

3、誘導(dǎo)凋亡的粒細(xì)胞表達(dá)熱休克蛋白并且引起Mψ的活化。我們應(yīng)用革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)和革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)感染所致的凋亡粒細(xì)胞作為研究模型，模擬機(jī)體內(nèi)被感染的環(huán)境，探討其對單核細(xì)胞來源的Mψ活性的影響，同時(shí)比較了紫外線照射誘導(dǎo)的非感染凋亡粒細(xì)胞對Mψ的作用。發(fā)現(xiàn)Mψ吞噬感染所誘導(dǎo)的凋亡粒細(xì)胞以后明顯增加TNF-α產(chǎn)量，并上調(diào)CD64(FcγRI)的表達(dá)；與此相反，吞噬老化或照射誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞可通過降低TNF-α和增加TGF-β來

4、抑制Mψ活性。雖然細(xì)菌本身可刺激Mψ活化，但這些感染后凋亡細(xì)胞所伴隨的細(xì)菌并不是它們活化Mψ的主要因素。說明在不同方式誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞中含有各自獨(dú)特的成分，從而決定了它們被Mψ吞噬后所產(chǎn)生的截然不同后果。進(jìn)一步的研究表明：粒細(xì)胞被細(xì)菌感染以后HSP60和HSP70的表達(dá)水平升高，這些熱休克蛋白會(huì)作為危險(xiǎn)信號激活Mψ，使之釋放TNF-α等炎癥因子。感染與非感染凋亡粒細(xì)胞，對Mψ的活化和功能有截然不同的影響，說明感染誘導(dǎo)粒細(xì)胞凋亡能作為一種新

5、的宿主防御微生物感染機(jī)制，輔助Mψ起到連接天然免疫和繼發(fā)性免疫的作用。在炎癥早期，粒細(xì)胞凋亡多由病原感染所致，吞噬這些細(xì)胞可激活Mψ而有助于控制病原；一旦病原被清除，在感染灶的多余粒細(xì)胞發(fā)生凋亡，吞噬這些非感染凋亡細(xì)胞可抑制Mψ活性，從而有助于炎癥的消退并減少組織損傷。 2)與細(xì)胞分化及腫瘤發(fā)生過程密切相關(guān)的人類microRNA(miRNA)的研究。miRNA是一類全長為19-25nt的單鏈小分子RNA，由莖環(huán)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄前體加工

6、而成。miRNA與靶標(biāo)基因3’-UTR結(jié)合，通過降解mRNA或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對靶標(biāo)基因的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控。越來越多的證據(jù)表明，miRNA的異常改變參與了免疫應(yīng)答過程。為了闡明miRNA在TAMs分化過程中的作用及其分子機(jī)理，在前期研究中，我們首先用實(shí)體瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)上清處理人外周血來源的單核細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫抑制型的TAMs，建立實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞模型；通過miRNA的芯片分析，篩選出一批調(diào)控TAMs分化的miRNA，并經(jīng)過進(jìn)

7、一步研究驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNA的功能。在本研究中我們選取一個(gè)在TAMs中表達(dá)顯著下調(diào)的miRNA(miR-155)進(jìn)行了較深入的功能探討。我們發(fā)現(xiàn)miR-155在實(shí)體瘤上清處理過的單核細(xì)胞中明顯下調(diào)，而它的靶基因C/EBPβ在蛋白水平顯著上調(diào)，兩者之間的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；接下來我們通過雙載體熒光報(bào)告系統(tǒng)和體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-155能夠轉(zhuǎn)錄后調(diào)控C/EBPβ的蛋白質(zhì)水平；此外，在TAMs中過表達(dá)miR-155能夠不僅能抑制C/EBPβ的