MTA調(diào)控人牙髓干細(xì)胞分化的分子機(jī)制的研究.pdf

1、活髓保存治療(包括蓋髓術(shù)和切髓術(shù))主要用于牙髓可復(fù)性損傷，是保證患牙健康的基礎(chǔ)，其目的是維持牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的活力與功能，要使活髓保存治療取得滿意療效，需要有良好的蓋髓材料以便將牙髓與感染組織隔離，并為牙髓組織的自身修復(fù)提供良好的生物學(xué)環(huán)境。MTA作為蓋髓劑可以有效隔絕外界刺激、保護(hù)牙髓，為牙髓修復(fù)提供適宜微環(huán)境，在誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞的分化和預(yù)防感染、促進(jìn)牙本質(zhì)橋形成方面發(fā)揮重要作用。人牙髓干細(xì)胞(Human Dental Plup Ste

2、m Cells，hDPSCs)是存在于牙髓組織中未分化間充質(zhì)細(xì)胞，具有多向分化潛能，可形成功能性的成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙本質(zhì)。近年來MAPKs信號途徑在細(xì)胞增殖和分化研究領(lǐng)域備受關(guān)注，作為一種進(jìn)化保守性細(xì)胞間相互作用機(jī)制，MAPKs信號途徑對多種細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過程都有影響。
　　本課題在對人牙髓干細(xì)胞進(jìn)行體外分離、培養(yǎng)和鑒定的基礎(chǔ)上，應(yīng)用MTT、Real-time PCR和Western blot等技術(shù)，研究MTA作用于人牙髓干

3、細(xì)胞后，對細(xì)胞存活、增殖與分化的影響，進(jìn)一步研究其對MAPKs各通路總蛋白和磷酸化蛋白的影響；并應(yīng)用MAPKs抑制劑和MTA聯(lián)合作用，特異性阻斷各MAPKs通路，觀察對MTA誘導(dǎo)人牙髓干細(xì)胞分化的影響。通過實(shí)驗(yàn)明確各MAPKs通路在MTA促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞中分化標(biāo)記基因表達(dá)增高中的具體調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步研究牙髓損傷修復(fù)過程中MTA促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞分化過程中的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
　　本研究共分為三個部分：
　　第一部分：MT

4、A對人牙髓干細(xì)胞增殖和分化的影響
　　目的：體外培養(yǎng)hDPSCs，觀察MTA對體外培養(yǎng)的hDPSCs的存活、增殖和分化的影響。
　　材料和方法：取正常19-25歲成人第三磨牙牙髓，體外分離克隆培養(yǎng)hDPSCs并鑒定；不同濃度MTA作用于hDPSCs不同時間后，通過MTT和Real-time PCR技術(shù)檢測MTA對hDPSC存活和增殖的影響，以及ALP、DSPP、BSP、OCN和COLImRNA表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：通

5、過倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查，以及免疫組織化學(xué)染色證明所培養(yǎng)細(xì)胞是hDPSCs；高濃度MTA(20mg/ml和10mg/ml)明顯減低細(xì)胞的存活率，低濃度MTA(2mg/ml及以下)對細(xì)胞無毒性，促進(jìn)hDPSCs的增殖，并且能引起ALP、DSPP、BSP、OCN和COLI基因的mRNA表達(dá)增高。
　　結(jié)論：成功分離和培養(yǎng)了hDPSCs，MTA能夠促進(jìn)hDPSCs的增殖和分化。
　　第二部分：MTA對人牙髓干細(xì)胞中MAPKs信

6、號通路蛋白表達(dá)的影響
　　目的：觀察MTA單獨(dú)作用及與MAPKs抑制劑聯(lián)合作用hDPSCs后，細(xì)胞中MAPKs各條通路蛋白表達(dá)的影響。
　　材料和方法：將hDPSCs隨機(jī)分為空白對照組和MTA作用不同時間組，利用Western blot方法檢測MTA作用后，hDPSCs中ERK1/2、JNK1/2和p38總蛋白和活性蛋白(磷酸化蛋白)的表達(dá)；再將hDPSCs隨機(jī)分為空白對照組、MTA陽性對照組和MTA與MAPKs抑制劑共同作

7、用組，Western blot檢測MTA和MAPKs通路抑制劑聯(lián)合應(yīng)用后，hDPSCs中三條通路總蛋白和磷酸化蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：在MTA作用下，加抑制劑前后，與對照組比較，2h內(nèi)hDPSCs中各MAPKs通路總蛋白沒有明顯變化；而各磷酸化蛋白則發(fā)生了明顯變化。在加抑制劑前，MTA作用15min后phos-ERK、phos-JNK、phos-p38表達(dá)明顯增高；而加入抑制劑后，各通路特異性抑制劑ERK(U0126)、p38(S

8、B203580)、JNK(SP600125)明顯降低了本通路磷酸化蛋白的表達(dá)。各組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：MTA不能引起MAPKs通路總蛋白的變化，卻能明顯促進(jìn)磷酸化蛋白的增高；MAPKs抑制劑能夠特異性抑制本通路MTA作用后磷酸化蛋白的表達(dá)。
　　第三部分：MAPKs通路在MTA誘導(dǎo)人牙髓干細(xì)胞分化過程中的作用
　　目的：應(yīng)用MAPKs阻滯劑與MTA共同作用hDPSCs后，觀察ALP、DSPP、BS

9、P、OCN和COLI的變化，明確各條通路在hDPSCs表達(dá)分化相關(guān)基因中的作用。
　　材料和方法：將hDPSCs隨機(jī)分為空白對照組、陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組，各通路抑制劑作用1h后，加入MTA作用12h，采用Real-timePCR法檢測ALP、DSPP、BSP、OCN和COLImRNA的變化。
　　結(jié)果：與陽性對照組相比，加入U0126后，各基因的表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；而加入SB203580和SP600125后，各基

10、因的mRNA表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：在MTA促進(jìn)hDPSCs分化標(biāo)記基因表達(dá)增高中，ERK通路起主要作用，而JNK和p38通路可能沒有參與此過程。
　　總之，本研究發(fā)現(xiàn)MTA可促進(jìn)hDPSCs的增殖和分化，并且能夠激活MAPKs通路，使hDPSCs中MAPKs磷酸化蛋白表達(dá)增高，其中ERKMAPK途徑可能參與了MTA促使hDPSCs向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞的分化。這一研究成果，為揭示MTA促進(jìn)hDPSCs向成牙