Biodentine在人牙髓干細(xì)胞增殖、遷移、黏附和分化中的作用及其相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、齲病是口腔的常見病,多發(fā)病之一。當(dāng)齲病發(fā)展至牙本質(zhì)時,細(xì)菌及其分泌的毒性產(chǎn)物可通過牙本質(zhì)小管侵入牙髓組織而導(dǎo)致其不同程度的損傷。當(dāng)損傷較嚴(yán)重時,原有的成牙本質(zhì)細(xì)胞死亡,牙髓發(fā)生炎癥,隨后牙髓組織中的牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells,DPSCs)增殖、遷移并黏附于損傷部位分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞(odontoblast-like cells,OBLCs),分泌修復(fù)性牙本質(zhì),保護(hù)牙髓。因此DPSCs增殖、遷移、黏附和成牙

2、/成骨向分化是牙髓損傷修復(fù)和治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié),這為研究牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的再生提供了重大的契機(jī)。
　　Biodentine是牙髓治療領(lǐng)域的一種新興材料。其主要成分為硅酸三鈣、碳酸鈣、二氧化鋯、硅酸二鈣、氧化鈣、氧化鐵、氯化鈣和高分子聚合物的還原劑。與三氧化礦物凝聚體(mineral trioxide aggregate,MTA)相比,Biodentine硬固時間短、微滲漏低和機(jī)械性能強(qiáng)。作為蓋髓劑能有效地隔絕外界因素刺激,保護(hù)牙髓組織

3、,誘導(dǎo)DPSCs分化為OBLCs,形成牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu),其在牙髓損傷修復(fù)過程具有潛在的優(yōu)勢及臨床應(yīng)用前景。那么 Biodentine能否誘導(dǎo)人牙髓干細(xì)胞的增殖、遷移、黏附和成牙/成骨向分化能力,目前尚未見文獻(xiàn)報道。因此,本課題在成功構(gòu)建hDPSCs細(xì)胞系的基礎(chǔ)上,研究Biodentine在hDPSCs的增殖、遷移、黏附以及成牙/成骨分化過程中的作用及其相關(guān)的分子機(jī)制,為將來臨床活髓保存治療和人牙髓干細(xì)胞組織工程應(yīng)用提供新思路。主要的研究結(jié)果

4、如下:
　　1.人牙髓干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　我們選取年輕患者因正畸拔除的新鮮健康第三磨牙,用組織塊聯(lián)合酶消化法分離和培養(yǎng)原代人牙髓細(xì)胞,有限稀釋法挑選單克隆細(xì)胞,擴(kuò)大培養(yǎng)獲得人牙髓干細(xì)胞系。利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行鑒定,同時通過成骨、成脂誘導(dǎo)實驗檢測細(xì)胞的多向分化潛能,證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為高純度的人牙髓干細(xì)胞。
　　2.Biodentine對人牙髓干細(xì)胞增殖能力的影響
　　制備 Biodentin

5、e浸提液;通過MTT和BrdU實驗檢測不同時間點不同濃度Biodentine浸提液(0.02-20 mg/ml)刺激二維平面hDPSCs后對其增殖能力的影響。MTT結(jié)果顯示,不同濃度Biodentine培養(yǎng)hDPSCs1、3、5和7天,0.2 mg/ml和2 mg/ml的Biodentine均可顯著促進(jìn)該細(xì)胞的增殖能力,Biodentine濃度為0.02 mg/ml時,細(xì)胞增殖與對照組比較沒有明顯的差異,而20 mg/ml的Bioden

6、tine顯著抑制hDPSCs的增殖,對其有毒性作用。BrdU結(jié)果顯示,不同濃度Biodentine刺激hDPSCs6、12、24和48小時,其檢測結(jié)果與MTT結(jié)果一致。
　　3.Biodentine對人牙髓干細(xì)胞遷移和黏附能力的影響
　　我們通過細(xì)胞劃痕和Transwell實驗探索Biodentine對hDPSCs遷移的作用;采用細(xì)胞黏附實驗確定Biodentine對hDPSCs黏附能力的影響;利用實時定量PCR技術(shù)進(jìn)一步分

7、析Biodentine誘導(dǎo)hDPSCs黏附和遷移過程中,細(xì)胞趨化因子和黏附分子mRNA表達(dá)的情況。通過細(xì)胞劃痕和Transwell實驗,我們發(fā)現(xiàn)0.2 mg/ml的Biodentine明顯促進(jìn)hDPSCs的遷移能力;細(xì)胞黏附實驗結(jié)果表明Biodentine濃度為0.2 mg/ml時能顯著提高h(yuǎn)DPSCs的黏附作用。此外,實時定量PCR結(jié)果顯示,0.2 mg/ml的Biodentine可有效地影響細(xì)胞趨化因子和黏附分子在hDPSCs中的表

8、達(dá)。
　　4.Biodentine在人牙髓干細(xì)胞分化中的作用及其相關(guān)機(jī)制研究
　　首先,用不同濃度Biodentine分別礦化誘導(dǎo)hDPSCs1、3、7、10、14和21天,通過堿性磷酸酶試劑盒檢測在細(xì)胞分化過程中堿性磷酸酶活性的變化。我們發(fā)現(xiàn)0.2 mg/ml和2 mg/ml Biodentine組堿性磷酸酶活性明顯高于對照組,而且14天時表達(dá)達(dá)到最高峰,提示Biodentine很可能在hDPSCs成牙/成骨向分化的中后期

9、發(fā)揮重要的作用。然后我們通過堿性磷酸酶染色、茜素紅染色和實時定量PCR檢測Biodentine對hDPSCs成牙/成骨向分化的影響。結(jié)果顯示,0.2 mg/ml和2 mg/ml Biodentine均可促進(jìn)該細(xì)胞向成牙/成骨分化的能力,其中以0.2 mg/ml Biodentine更為顯著。以上結(jié)果證明Biodentine能有效地促進(jìn)hDPSCs的成牙/成骨向分化,但是相關(guān)的分子機(jī)制尚不清楚。
　　為了探索Biodentine調(diào)控

10、hDPSCs成牙/成骨向分化的分子機(jī)制,我們進(jìn)一步通過茜素紅染色、實時定量PCR實驗和蛋白質(zhì)印跡技術(shù),初步探討如核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)、鈣調(diào)素依賴蛋白激酶II(calcium/calmodulin dependent protein kinase II,CaMKII)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路在Biodenti

11、ne誘導(dǎo)hDPSCs成牙/成骨向分化過程中的作用。我們發(fā)現(xiàn)含有不同通路抑制劑的0.2 mg/ml Biodentine礦化誘導(dǎo)hDPSCs14天后,NF-κB抑制劑(PDTC)顯著增強(qiáng)Biodentine誘導(dǎo)hDPSCs礦化結(jié)節(jié)的形成、成牙/成骨基因OCN、DSPP、DMP1及BSP mRNA的表達(dá)和相關(guān)蛋白的活化,而CaMKII抑制劑(KN-93)和MAPK(ERK和JNK)抑制劑(U0126和SP600125)明顯抑制Biodent

12、ine誘導(dǎo)該細(xì)胞成牙/成骨向分化的能力,此外,MAPK(p38)抑制劑(SB203580)在Biodentine調(diào)控hDPSCs成牙/成骨向分化過程中不發(fā)揮作用。
　　綜上所述,我們的實驗證實了一定濃度的Biodentine對人牙髓干細(xì)胞的增殖、遷移、黏附和成牙/成骨向分化的能力有著不同程度的影響.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CaMKII和MAPK信號通路參與Biodentine調(diào)控人牙髓干細(xì)胞的成牙/成骨向分化,并發(fā)揮著重要的作用。這為研究人