P物質(zhì)誘導肌腱干細胞增殖分化及其在肌腱病形成中的作用.pdf

1、背景：
　　肌腱病是一組由于過度使用導致的肌肉骨骼疾病的總稱，發(fā)病率約為2％～65％，占所有運動相關(guān)疾病的30％～50％，逐漸成為影響人類運動能力和生活質(zhì)量的主要疾病之一。目前，關(guān)于肌腱病的治療方法沒有統(tǒng)一的標準，治療效果不甚滿意，復發(fā)率高，根本原因在于肌腱病的發(fā)病機制尚未確切，導致治療上缺乏針對性。
　　隨著研究工作的深入，神經(jīng)性炎癥在肌腱病發(fā)病機制中的作用日益受到關(guān)注。P物質(zhì)(Substance P,SP)是一種重要的促

2、炎癥反應的介質(zhì)，參與痛覺傳遞和加劇神經(jīng)源性炎癥反應。有研究發(fā)現(xiàn)，肌腱病組織中SP及其受體NK-1R表達升高，肌腱病變及臨床癥狀與SP陽性的神經(jīng)纖維增多相關(guān)，并且SP能促進肌腱組織增生、膠原重塑、肌腱細胞增殖并加速肌腱的無菌性反應;同時，SP還是具有機械反應性的炎癥介質(zhì)，肌腱細胞在體外機械牽伸的條件下分泌SP;SP還可影響干細胞的分化，如促進骨髓基質(zhì)干細胞向成骨細胞分化。
　　肌腱干細胞(TSCs)作為肌腱細胞的唯一前體細胞，具有較

3、強的增殖和分化能力，TSCs的分化命運是決定肌腱微損傷修復成功與否的關(guān)鍵因素之一。TSCs的分化受各種機械和生化因素的影響。適度機械牽伸(4％)可誘導TSCs正常分化為肌腱細胞，促進損傷的自我修復;過度機械牽伸(8％)可誘導TSCs異常分化為成脂肪、成軟骨和成骨細胞，促進肌腱病形成。已有研究發(fā)現(xiàn)機械牽伸可刺激TSCs分泌炎癥介質(zhì)，而且某些炎癥介質(zhì)也可影響TSCs的增殖和分化，為闡明肌腱病的發(fā)病機制提供了新的思路?；仡櫸墨I，有關(guān)SP對TS

4、Cs增殖和多向分化的作用還未見報道。
　　目的：
　　本研究的主要目的包括觀察臨床肌腱病標本的SP表達情況與病理學特征;利用離體細胞模型明確過度牽伸對TSCs分泌SP的作用、SP對TSCs增殖和分化的影響;利用在體動物模型觀察外源性SP在肌腱病形成中的作用。
　　材料與方法：
　　1.肌腱病SP表達與病理學特征觀察
　　2013年5月至2014年4月在我院行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)的患者，分為兩組。腱病組:關(guān)節(jié)鏡證實為肩

5、袖腱病的的患者，取岡上肌腱標本，共15例;對照組:行關(guān)節(jié)鏡下肩關(guān)節(jié)穩(wěn)定手術(shù)的患者，取肩胛下肌腱標本，共8例。用免疫熒光染色檢測臨床標本的SP表達，并進行半定量的統(tǒng)計學分析;人肩袖腱病組織的組織學評估，包括H-E染色、Masson染色觀察以及組織病理學評分。
　　2.過度機械牽伸對TSCs分化和SP表達的影響
　　TSCs的分離培養(yǎng)與鑒定。觀察TSCs的細胞形態(tài)和克隆形成能力;免疫熒光檢測干細胞標志物(Nanog，Nucleo

6、stemin和Oct-4)和SP及其受體NK-1R的表達;流式細胞術(shù)對細胞的表面標志抗原進行檢測，包括CD31、CD34、CD44和CD90;為驗證TSCs的多向分化能力，分別對TSCs進行成骨、成脂肪和成軟骨誘導分化。利用我們課題組前期自行設計制作的新型體外細胞機械牽伸模型，對TSCs進行機械牽伸(8％，1HZ);用RT-PCR檢測其SP及其受體NK-1R的基因表達情況;用Western-Blot和ELISA法檢測SP及其受體NK-1

7、R的蛋白表達水平。加入NK-1R拮抗劑（5×10-6M）后，對TSCs進行機械牽伸;用RT-PCR檢測TSCs的多向分化基因表達情況。
　　3.SP對TSCs增殖、凋亡和異常分化的影響
　　CCK-8檢測不同濃度SP對TSCs增殖的影響;（對照組、10-6M的SP組、10-7M的SP組、10-8M的SP組、10-9M的SP組和10-10M的SP組)
　　CCK-8檢測SP和NK-1R拮抗劑對TSCs增殖的影響;結(jié)晶紫染

8、色檢測SP和NK-1R拮抗劑對TSCs活力的影響;細胞爬片Ki67免疫熒光檢測SP和NK-1R拮抗劑對TSCs增殖的影響;流式細胞學檢測SP和NK-1R拮抗劑對TSCs凋亡的影響。（對照組、5×10-6M的NK-1R拮抗劑+10-6M的SP組、10-6M的SP組）
　　RT-PCR和免疫熒光檢測(10-6M)SP對TSCs的干性的影響;多向誘導分化檢測(10-6M)SP對TSCs的分化的影響;
　　RT-PCR檢測SP和NK

9、-1R拮抗劑對TSCs分化相關(guān)基因的表達的影響;免疫熒光檢測SP和NK-1R拮抗劑對TSCs分化相關(guān)蛋白的表達的影響。(對照組、5×10-6M的NK-1R拮抗劑+10-6M的SP組、10-6M的SP組)
　　4.外源性SP對大鼠肌腱病形成的作用
　　將36只SD大鼠隨機分為三組，即對照組（生理鹽水）、低劑量SP組(0.5×10-6M)和高劑量SP組(5×10-6M)。每組12只。分別于14天和28天各處死18只大鼠（每組6只

10、），取跟腱標本。大鼠肌腱標本的組織學檢測，包括H-E染色、Masson染色觀察以及組織學評分;免疫熒光檢測肌腱成脂肪、成軟骨和成骨相關(guān)蛋白表達情況。
　　結(jié)果
　　1.免疫熒光檢測結(jié)果顯示，肌腱病組和對照組的SP和NK-1R均有表達，肌腱病組的SP陽性面積百分比顯著大于對照組(P＜0.05)。組織學評分結(jié)果顯示，肌腱病組的組織學評分顯著高于對照組(P＜0.05)。肌腱病組的膠原纖維結(jié)構(gòu)破壞，排列紊亂、卷曲，組織增生，細胞明顯

11、增多，細胞核變性、碎裂，新生血管形成，甚至可見脂肪樣變和玻璃樣變等。
　　2.過度機械牽伸導致TSCs的SP基因和蛋白水平表達顯著升高(P＜0.05)。過度機械牽伸導致TSCs的非肌腱細胞相關(guān)基因表達明顯增高，如Runx2（成骨細胞標志），PPARγ（成脂肪細胞標志），Sox9和Collagen typeⅡ（成軟骨細胞標志）(P＜0.05)，加入NK-1R拮抗劑組的PPARγ，Sox9和Collagen typeⅡ的表達較牽伸組顯

12、著降低(P＜0.05)。
　　3.CCK-8結(jié)果顯示SP促進了TSCs增殖，并且劑量和時間依賴性的;結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示SP增加了TSCs的細胞活力;流式細胞學檢測結(jié)果顯示SP抑制了TSCs的凋亡。SP對TSCs增殖和凋亡的作用可有效地被NK-1R拮抗劑所抑制。
　　SP降低了TSCs的干性。RT-PCR結(jié)果顯示，SP組的干細胞相關(guān)基因Nanog和Nuclestemin的表達均顯著低于對照組(P＜0.05);免疫熒光檢測結(jié)果顯

13、示，SP組的Nanog和Nuclestemin染色的陽性細胞數(shù)均顯著低于對照組(P＜0.05)。
　　SP促進TSCs成脂肪和成軟骨分化。RT-PCR結(jié)果顯示，SP組的成脂肪(PPARγ)和成軟骨(ColⅡ，Sox9)基因表達均顯著高于對照組(P＜0.05)，成骨(Runx2)基因表達差異不顯著(P＞0.05)，而成肌腱的標志基因(TNC，Tnmd)則顯著減低(P＜0.05);SP+NK-1R拮抗劑組的成脂肪(PPARγ)和成軟骨

14、(ColⅡ，Sox9)基因表達顯著的低于SP組(P＜0.05);而SP+NK-1R拮抗劑組與對照組的相關(guān)基因表達無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。免疫熒光染色檢測結(jié)果進一步證實了上述結(jié)果。
　　4.組織學評分結(jié)果顯示，高劑量SP組的總評分顯著高于低劑量SP組和對照組(P＜0.05)，而低劑量SP組與對照組差異不顯著(P＞0.05);免疫熒光結(jié)果顯示，高劑量SP組的PPARγ和ColⅡ表達均顯著高于低劑量SP組和對照組(P＜0.05);

15、低劑量SP組的PPARγ、ColⅡ和Runx2的表達較對照組差異不顯著(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.證實了肌腱病組和正常組都可表達SP，但肌腱病組織中SP表達更強烈;驗證了肩袖腱病的病理學特征符合肌腱病的普遍組織病理學表現(xiàn)，如膠原纖維結(jié)構(gòu)破壞、排列紊亂、組織增生、細胞增多、新生血管形成、脂肪樣變和玻璃樣變等。
　　2.過度機械牽伸可刺激TSCs分泌SP;過度機械牽伸可促進TSCs異常分化;NK-1R拮抗劑可有

16、效抑制過度牽伸導致的TSCs成脂肪和成軟骨分化。
　　3.SP通過其受體NK-1R刺激TSCs增殖和抑制TSCs凋亡，可能通過促進肌腱組織增生和細胞增多而加快肌腱病的形成;SP通過其受體NK-1R促進TSCs成脂肪和成軟骨分化，可能通過促進脂肪變性和軟骨化對肌腱病的形成起促進作用。
　　4.外源性SP促進大鼠肌腱組織增生、細胞增多、新生血管形成和膠原紊亂并導致脂肪化和軟骨化等肌腱病形成的作用呈劑量依賴性，即低劑量SP促肌腱病