P物質(zhì)誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞增殖分化及其在肌腱病形成中的作用.pdf

1、背景：
　　肌腱病是一組由于過度使用導(dǎo)致的肌肉骨骼疾病的總稱，發(fā)病率約為2％～65％，占所有運(yùn)動相關(guān)疾病的30％～50％，逐漸成為影響人類運(yùn)動能力和生活質(zhì)量的主要疾病之一。目前，關(guān)于肌腱病的治療方法沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，治療效果不甚滿意，復(fù)發(fā)率高，根本原因在于肌腱病的發(fā)病機(jī)制尚未確切，導(dǎo)致治療上缺乏針對性。
　　隨著研究工作的深入，神經(jīng)性炎癥在肌腱病發(fā)病機(jī)制中的作用日益受到關(guān)注。P物質(zhì)(Substance P,SP)是一種重要的促

2、炎癥反應(yīng)的介質(zhì)，參與痛覺傳遞和加劇神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，肌腱病組織中SP及其受體NK-1R表達(dá)升高，肌腱病變及臨床癥狀與SP陽性的神經(jīng)纖維增多相關(guān)，并且SP能促進(jìn)肌腱組織增生、膠原重塑、肌腱細(xì)胞增殖并加速肌腱的無菌性反應(yīng);同時，SP還是具有機(jī)械反應(yīng)性的炎癥介質(zhì)，肌腱細(xì)胞在體外機(jī)械牽伸的條件下分泌SP;SP還可影響干細(xì)胞的分化，如促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。
　　肌腱干細(xì)胞(TSCs)作為肌腱細(xì)胞的唯一前體細(xì)胞，具有較

3、強(qiáng)的增殖和分化能力，TSCs的分化命運(yùn)是決定肌腱微損傷修復(fù)成功與否的關(guān)鍵因素之一。TSCs的分化受各種機(jī)械和生化因素的影響。適度機(jī)械牽伸(4％)可誘導(dǎo)TSCs正常分化為肌腱細(xì)胞，促進(jìn)損傷的自我修復(fù);過度機(jī)械牽伸(8％)可誘導(dǎo)TSCs異常分化為成脂肪、成軟骨和成骨細(xì)胞，促進(jìn)肌腱病形成。已有研究發(fā)現(xiàn)機(jī)械牽伸可刺激TSCs分泌炎癥介質(zhì)，而且某些炎癥介質(zhì)也可影響TSCs的增殖和分化，為闡明肌腱病的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路?；仡櫸墨I(xiàn)，有關(guān)SP對TS

4、Cs增殖和多向分化的作用還未見報道。
　　目的：
　　本研究的主要目的包括觀察臨床肌腱病標(biāo)本的SP表達(dá)情況與病理學(xué)特征;利用離體細(xì)胞模型明確過度牽伸對TSCs分泌SP的作用、SP對TSCs增殖和分化的影響;利用在體動物模型觀察外源性SP在肌腱病形成中的作用。
　　材料與方法：
　　1.肌腱病SP表達(dá)與病理學(xué)特征觀察
　　2013年5月至2014年4月在我院行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)的患者，分為兩組。腱病組:關(guān)節(jié)鏡證實(shí)為肩

5、袖腱病的的患者，取岡上肌腱標(biāo)本，共15例;對照組:行關(guān)節(jié)鏡下肩關(guān)節(jié)穩(wěn)定手術(shù)的患者，取肩胛下肌腱標(biāo)本，共8例。用免疫熒光染色檢測臨床標(biāo)本的SP表達(dá)，并進(jìn)行半定量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;人肩袖腱病組織的組織學(xué)評估，包括H-E染色、Masson染色觀察以及組織病理學(xué)評分。
　　2.過度機(jī)械牽伸對TSCs分化和SP表達(dá)的影響
　　TSCs的分離培養(yǎng)與鑒定。觀察TSCs的細(xì)胞形態(tài)和克隆形成能力;免疫熒光檢測干細(xì)胞標(biāo)志物(Nanog，Nucleo

6、stemin和Oct-4)和SP及其受體NK-1R的表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞的表面標(biāo)志抗原進(jìn)行檢測，包括CD31、CD34、CD44和CD90;為驗(yàn)證TSCs的多向分化能力，分別對TSCs進(jìn)行成骨、成脂肪和成軟骨誘導(dǎo)分化。利用我們課題組前期自行設(shè)計(jì)制作的新型體外細(xì)胞機(jī)械牽伸模型，對TSCs進(jìn)行機(jī)械牽伸(8％，1HZ);用RT-PCR檢測其SP及其受體NK-1R的基因表達(dá)情況;用Western-Blot和ELISA法檢測SP及其受體NK-1

7、R的蛋白表達(dá)水平。加入NK-1R拮抗劑（5×10-6M）后，對TSCs進(jìn)行機(jī)械牽伸;用RT-PCR檢測TSCs的多向分化基因表達(dá)情況。
　　3.SP對TSCs增殖、凋亡和異常分化的影響
　　CCK-8檢測不同濃度SP對TSCs增殖的影響;（對照組、10-6M的SP組、10-7M的SP組、10-8M的SP組、10-9M的SP組和10-10M的SP組)
　　CCK-8檢測SP和NK-1R拮抗劑對TSCs增殖的影響;結(jié)晶紫染

8、色檢測SP和NK-1R拮抗劑對TSCs活力的影響;細(xì)胞爬片Ki67免疫熒光檢測SP和NK-1R拮抗劑對TSCs增殖的影響;流式細(xì)胞學(xué)檢測SP和NK-1R拮抗劑對TSCs凋亡的影響。（對照組、5×10-6M的NK-1R拮抗劑+10-6M的SP組、10-6M的SP組）
　　RT-PCR和免疫熒光檢測(10-6M)SP對TSCs的干性的影響;多向誘導(dǎo)分化檢測(10-6M)SP對TSCs的分化的影響;
　　RT-PCR檢測SP和NK

9、-1R拮抗劑對TSCs分化相關(guān)基因的表達(dá)的影響;免疫熒光檢測SP和NK-1R拮抗劑對TSCs分化相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響。(對照組、5×10-6M的NK-1R拮抗劑+10-6M的SP組、10-6M的SP組)
　　4.外源性SP對大鼠肌腱病形成的作用
　　將36只SD大鼠隨機(jī)分為三組，即對照組（生理鹽水）、低劑量SP組(0.5×10-6M)和高劑量SP組(5×10-6M)。每組12只。分別于14天和28天各處死18只大鼠（每組6只

10、），取跟腱標(biāo)本。大鼠肌腱標(biāo)本的組織學(xué)檢測，包括H-E染色、Masson染色觀察以及組織學(xué)評分;免疫熒光檢測肌腱成脂肪、成軟骨和成骨相關(guān)蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果
　　1.免疫熒光檢測結(jié)果顯示，肌腱病組和對照組的SP和NK-1R均有表達(dá)，肌腱病組的SP陽性面積百分比顯著大于對照組(P＜0.05)。組織學(xué)評分結(jié)果顯示，肌腱病組的組織學(xué)評分顯著高于對照組(P＜0.05)。肌腱病組的膠原纖維結(jié)構(gòu)破壞，排列紊亂、卷曲，組織增生，細(xì)胞明顯

11、增多，細(xì)胞核變性、碎裂，新生血管形成，甚至可見脂肪樣變和玻璃樣變等。
　　2.過度機(jī)械牽伸導(dǎo)致TSCs的SP基因和蛋白水平表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。過度機(jī)械牽伸導(dǎo)致TSCs的非肌腱細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)明顯增高，如Runx2（成骨細(xì)胞標(biāo)志），PPARγ（成脂肪細(xì)胞標(biāo)志），Sox9和Collagen typeⅡ（成軟骨細(xì)胞標(biāo)志）(P＜0.05)，加入NK-1R拮抗劑組的PPARγ，Sox9和Collagen typeⅡ的表達(dá)較牽伸組顯

12、著降低(P＜0.05)。
　　3.CCK-8結(jié)果顯示SP促進(jìn)了TSCs增殖，并且劑量和時間依賴性的;結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示SP增加了TSCs的細(xì)胞活力;流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果顯示SP抑制了TSCs的凋亡。SP對TSCs增殖和凋亡的作用可有效地被NK-1R拮抗劑所抑制。
　　SP降低了TSCs的干性。RT-PCR結(jié)果顯示，SP組的干細(xì)胞相關(guān)基因Nanog和Nuclestemin的表達(dá)均顯著低于對照組(P＜0.05);免疫熒光檢測結(jié)果顯

13、示，SP組的Nanog和Nuclestemin染色的陽性細(xì)胞數(shù)均顯著低于對照組(P＜0.05)。
　　SP促進(jìn)TSCs成脂肪和成軟骨分化。RT-PCR結(jié)果顯示，SP組的成脂肪(PPARγ)和成軟骨(ColⅡ，Sox9)基因表達(dá)均顯著高于對照組(P＜0.05)，成骨(Runx2)基因表達(dá)差異不顯著(P＞0.05)，而成肌腱的標(biāo)志基因(TNC，Tnmd)則顯著減低(P＜0.05);SP+NK-1R拮抗劑組的成脂肪(PPARγ)和成軟骨

14、(ColⅡ，Sox9)基因表達(dá)顯著的低于SP組(P＜0.05);而SP+NK-1R拮抗劑組與對照組的相關(guān)基因表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。免疫熒光染色檢測結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果。
　　4.組織學(xué)評分結(jié)果顯示，高劑量SP組的總評分顯著高于低劑量SP組和對照組(P＜0.05)，而低劑量SP組與對照組差異不顯著(P＞0.05);免疫熒光結(jié)果顯示，高劑量SP組的PPARγ和ColⅡ表達(dá)均顯著高于低劑量SP組和對照組(P＜0.05);

15、低劑量SP組的PPARγ、ColⅡ和Runx2的表達(dá)較對照組差異不顯著(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.證實(shí)了肌腱病組和正常組都可表達(dá)SP，但肌腱病組織中SP表達(dá)更強(qiáng)烈;驗(yàn)證了肩袖腱病的病理學(xué)特征符合肌腱病的普遍組織病理學(xué)表現(xiàn)，如膠原纖維結(jié)構(gòu)破壞、排列紊亂、組織增生、細(xì)胞增多、新生血管形成、脂肪樣變和玻璃樣變等。
　　2.過度機(jī)械牽伸可刺激TSCs分泌SP;過度機(jī)械牽伸可促進(jìn)TSCs異常分化;NK-1R拮抗劑可有

16、效抑制過度牽伸導(dǎo)致的TSCs成脂肪和成軟骨分化。
　　3.SP通過其受體NK-1R刺激TSCs增殖和抑制TSCs凋亡，可能通過促進(jìn)肌腱組織增生和細(xì)胞增多而加快肌腱病的形成;SP通過其受體NK-1R促進(jìn)TSCs成脂肪和成軟骨分化，可能通過促進(jìn)脂肪變性和軟骨化對肌腱病的形成起促進(jìn)作用。
　　4.外源性SP促進(jìn)大鼠肌腱組織增生、細(xì)胞增多、新生血管形成和膠原紊亂并導(dǎo)致脂肪化和軟骨化等肌腱病形成的作用呈劑量依賴性，即低劑量SP促肌腱病