機(jī)械牽伸頻率對(duì)肌腱干細(xì)胞增殖分化的影響.pdf

1、研究背景:
　　肌腱病(Tendinopathy)是目前運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)及骨科學(xué)面臨的主要傷病之一。在美國(guó),每年有1640萬(wàn)人肌腱和韌帶有損傷,至少10萬(wàn)人是跟腱病。
　　肌腱病病因包括許多內(nèi)在和外在因素,其中反復(fù)、過(guò)度的應(yīng)力負(fù)荷是肌腱病發(fā)展過(guò)程中主要致病因素。應(yīng)力負(fù)荷包括不同應(yīng)變、頻率及時(shí)間三種因素。高運(yùn)動(dòng)頻率可能是肌腱病發(fā)生的主要相關(guān)因素:Kujala等提出跟腱病累積發(fā)病率在中長(zhǎng)跑運(yùn)動(dòng)員中比較高,跟腱斷裂累積發(fā)病率在短跑運(yùn)動(dòng)員中

2、較高(中長(zhǎng)跑運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)頻率約為3.0Hz,短跑運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)頻率約為4.5Hz);吳子英等提出低頻率牽伸對(duì)受損跟腱有修復(fù)作用,而高頻率牽伸可造成跟腱病的發(fā)生。
　　過(guò)度應(yīng)力負(fù)荷可能是TSCs異常分化的主要原因之一。Zhang和Shi提出不同應(yīng)變及時(shí)間對(duì)TSCs分化有影響,但目前不同頻率對(duì)TSCs增殖分化影響不清楚?在體外細(xì)胞循環(huán)牽伸載荷模型中,單軸牽伸模型較好模擬體內(nèi) TSCs受力情況,被用于研究應(yīng)力負(fù)荷條件下TSCs對(duì)肌腱病的影響。

3、目前體外細(xì)胞單軸循環(huán)載荷模型主要有STREX系列、Wang及我們課題組曹洪輝前期研制的牽伸模型,但以上牽伸模型頻率參數(shù)均較低,不能滿足本課題的實(shí)驗(yàn)條件,且在其它方面也存在需改進(jìn)的地方。
　　研究目的:
　　建立一種多頻率新型單軸循環(huán)牽伸模型;確立適度及過(guò)度牽伸頻率閾值,初步探討不同牽伸頻率對(duì)TSCs增殖分化的影響,為進(jìn)一步研究運(yùn)動(dòng)負(fù)荷對(duì)肌腱病的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　一、多頻率單軸循環(huán)牽伸載荷模型的建

4、立
　　1、硅樹脂培養(yǎng)皿制備及有限元分析
　　用PDMS制備微溝槽細(xì)胞培養(yǎng)皿;有限元軟件ABAQUS對(duì)新設(shè)計(jì)及前期設(shè)計(jì)硅樹脂細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行分析。
　　2、機(jī)械部分運(yùn)行穩(wěn)定性及有效牽伸性能測(cè)試
　　觀察牽伸模型機(jī)械部分運(yùn)行穩(wěn)定性;檢測(cè)培養(yǎng)皿實(shí)際運(yùn)行頻率及被牽伸前后應(yīng)變位移量變化;LSCM觀察TSCs被牽伸前后F-actin形態(tài)變化。
　　二、牽伸頻率對(duì)體外培養(yǎng)SD大鼠TSCs增殖分化的影響
　　1、SD

5、大鼠來(lái)源TSCs分離、培養(yǎng)與鑒定
　?、倭魇郊?xì)胞儀檢測(cè)TSCs增殖能力;
　　②流式細(xì)胞儀及激光共聚焦觀察干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)情況;
　?、刍瘜W(xué)誘導(dǎo)法觀察TSCs多向分化能力。
　　2、觀察和檢測(cè)牽伸頻率對(duì)TSCs形變和增殖的影響
　　3、real-time PCR和Western blot檢測(cè)牽伸頻率對(duì)TSCs分化的影響
　　結(jié)果:
　　一、新培養(yǎng)皿應(yīng)變分布均勻,牽伸模型操作簡(jiǎn)便,設(shè)計(jì)參數(shù)寬

6、>　　1、TSCs在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)板上和在硅樹脂材料上增殖無(wú)顯著差異(p>0.05);當(dāng)槽深為3μm時(shí),較適合規(guī)范TSCs生長(zhǎng)取向;新設(shè)計(jì)的硅樹脂培養(yǎng)皿在應(yīng)力、位移及應(yīng)變分布方面優(yōu)于前期設(shè)計(jì)的培養(yǎng)皿。
　　2、機(jī)械部分運(yùn)行穩(wěn)定;培養(yǎng)皿被牽伸前后彈性無(wú)明顯變化;牽伸組TSCs無(wú)明顯脫落;培養(yǎng)皿實(shí)際運(yùn)行頻率、位移距離和設(shè)定頻率及理論應(yīng)變位移距離比較無(wú)明顯差異(P﹥0.05);牽伸組F-actin束變細(xì)且部分發(fā)生斷裂、解聚。
　　二

7、、牽伸頻率對(duì)TSCs增殖、分化有影響
　　1、TSCs具有干細(xì)胞特性
　?、?TSCs成集落樣克隆性生長(zhǎng);
　　②流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD90及CD44(+),CD106及CD11b(-);免疫熒光檢測(cè)Ⅰ型膠原(+)、Ⅲ型膠原(-)、SSEA-4(+)、Nucleostemin(+);
　?、圮缢丶t染色后,細(xì)胞內(nèi)有較多的鈣結(jié)節(jié)形成;油紅染色后,胞漿內(nèi)大量紅染脂滴;甲苯胺藍(lán)溶液染色后,見藍(lán)染酸性糖胺聚糖。
　　2、

8、牽伸頻率對(duì)TSCs形態(tài)、生長(zhǎng)方向及增殖有影響
　?、僭诘啄す饣墓铇渲笾?牽伸組TSCs外形由鵝卵石樣變?yōu)殚L(zhǎng)梭形,生長(zhǎng)方向與牽拉軸方向大致相同;在帶微溝槽的硅樹脂皿中,TSCs呈長(zhǎng)梭形沿微溝槽方向排列生長(zhǎng);
　?、诘皖l率牽伸對(duì) TSCs增殖無(wú)影響(P﹥0.05);高頻率牽伸使 TSCs增殖下降(P﹤0.05)。
　　3、牽伸頻率對(duì)TSCs分化有影響
　　低頻率牽伸對(duì)TSCs成肌腱、成骨分化無(wú)影響(P﹥0.05)

9、;高頻率牽伸使TSCs向成肌腱方向分化降低,而向成骨方向分化增加(P﹤0.05);牽伸頻率對(duì)TSCs成脂肪及軟骨分化無(wú)影響(P﹥0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、新制備的硅樹脂培養(yǎng)皿應(yīng)變分布均勻,是一種較理想的用于貼壁細(xì)胞牽伸實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)皿;多頻率牽伸模型設(shè)計(jì)參數(shù)寬、操作簡(jiǎn)便,適用于體外貼壁細(xì)胞生物力學(xué)載荷實(shí)驗(yàn)研究。
　　2、SD大鼠來(lái)源TSCs具有一般干細(xì)胞特性;低頻率牽伸對(duì)TSCs增殖和分化無(wú)影響;高頻率牽伸使TSCs