整合素β1對人表皮干細胞增殖與分化的影響.pdf

1、表皮干細胞(keratinocytestemcell，KSC)位于表皮基底層，具有強大的增殖潛能，可分化形成全層表皮，并具有產(chǎn)生皮膚附件的作用，是潛在的多能干細胞。由于表皮干細胞數(shù)量少，而且體外培養(yǎng)很容易分化，所以對培養(yǎng)KSC的生物學(xué)特性進行深入研究具有重要的意義。探究如何在體外培養(yǎng)獲得足夠數(shù)量的KSC用于研究及移植、如何在體內(nèi)外誘導(dǎo)KSC定向分化是KSC研究的又一重要課題，解決這些問題的關(guān)鍵在于研究KSC增殖與分化的調(diào)控機制。

2、 本室先期已對不同來源皮膚中的KSC的定位分布進行了研究，對KSC進行了初步的分離培養(yǎng)。本研究主要探討分離純化人KSC的方法，觀察KSC在體外培養(yǎng)條件下的生長及分化特性。針對目的基因整合素β1(integrinβ1)構(gòu)建siRNA表達質(zhì)粒并鑒定，探討下調(diào)KSC中整合素β1的表達對KSC增殖與分化的影響。 將人表皮細胞接種在Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)瓶中粘附10min，取粘附的類KSC以低密度接種于滋養(yǎng)層上，培養(yǎng)14d后挑選KSC克隆分散

3、培養(yǎng)，觀察其克隆再形成率，通過免疫細胞熒光染色法檢測培養(yǎng)KSC中interginβ1及involucrin的表達水平，分析其細胞周期。將一個KSC克隆的所有子代細胞消化后接種，連續(xù)傳代，培養(yǎng)14d后計算克隆形成率(CFE)，觀察KSC子代細胞的總體分化情況。 針對目的基因integrinβ1選擇了兩個RNAi作用靶點，構(gòu)建到pSilencer3.1/H1-Hygro載體上，通過酶切及測序鑒定重組陽性質(zhì)粒。將低密度接種的KSC克隆

4、挑選出來分散后接種，待細胞長至60％左右匯合時轉(zhuǎn)染，用不同比例脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Dotap介導(dǎo)轉(zhuǎn)染不同劑量報告基因EGFP，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。重組陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人KSC，通過定量westernblot、半定量RT-PCR檢測對目的基因的抑制效率，篩選出最有效的RNAi作用靶點，將其重組質(zhì)粒命名為siIntegrinβ1。 重組質(zhì)粒siIntegrinβ1轉(zhuǎn)染人KSC48～72h后，提取細胞總蛋白及總RNA，通過定量westernblot、

5、半定量RT-PCR檢測對目的基因的抑制效率；并對RNAi后KSC行細胞周期分析。挑選RNAi后48～72h的KSC克隆分散后接種于滋養(yǎng)層上，培養(yǎng)14d后用1％羅丹藍染色計算CFE，觀察下調(diào)integrinβ1的表達對KSC增殖與分化的影響，并設(shè)有效的對照組(非轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染pSilencer3.1/H1組、轉(zhuǎn)染siNegative組)。 研究發(fā)現(xiàn)，利用Ⅳ型膠原快速粘附法富集KSC，結(jié)合低密度單克隆挑選可以提高KSC篩選效率及純度。

6、KSC在培養(yǎng)過程中可見三種克隆形態(tài)共存的現(xiàn)象：即全克隆(holoclone)、短暫增殖克隆(meroclone)、終末克隆(paraclone)。只有全克隆可以連續(xù)傳代，并進一步增殖分化出所有三種類型的克隆，其他克隆不能傳代培養(yǎng)。KSC克隆的子代細胞在體外培養(yǎng)會逐漸發(fā)生分化，但仍保留一定比例的干細胞數(shù)。 載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)能夠下調(diào)KSC中integrinβ1的表達。針對靶基因integrinβ1設(shè)計和構(gòu)建了兩個重組質(zhì)粒siI

7、ntegrinβ1-1和siIntegrinβ1-2，并轉(zhuǎn)染人KSC，能夠不同程度的下調(diào)integrinβ1的蛋白表達，其中靶點二的抑制效率高于靶點一，抑制效率達到了60～70％。提示H1啟動子介導(dǎo)的細胞內(nèi)合成siRNA策略，能夠成功地在KSC中應(yīng)用，為進一步研究integrinβ1在KSC中的功能奠定了基礎(chǔ)。 RNAi技術(shù)干擾整合素β1基因表達可促進KSC分化。挑取RNAi后48～72h的KSC克隆，培養(yǎng)14d后計算克隆再形成