Wnt-1的生物信息學(xué)分析及其對(duì)人表皮干細(xì)胞分化與增殖的影響的研究.pdf

1、表皮干細(xì)胞是皮膚組織特異性干細(xì)胞，位于表皮基底層，在維持表皮更新，保持細(xì)胞恒定等方面起著重要作用，它也是皮膚及其附屬器官發(fā)生、修復(fù)、改建的關(guān)鍵性源泉。表皮干細(xì)胞的增殖與分化不僅為自身基因所預(yù)先設(shè)置，還受到干細(xì)胞“壁龕”(Niche)的調(diào)控。Wnt家族是干細(xì)胞“壁龕”中重要的組成部分，參與細(xì)胞分化、細(xì)胞極性、細(xì)胞遷移以及細(xì)胞增殖等過程。其中，Wnt-1在神經(jīng)上皮的發(fā)育、乳腺癌的發(fā)生等上皮性組織的發(fā)育與分化的過程中扮演著重要的角色。Wnt-

2、1的表達(dá)與皮膚及其附屬器的發(fā)育在時(shí)相上一致：Wnt-1在胚胎時(shí)期表達(dá)活躍，而成年時(shí)多處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)；人表皮干細(xì)胞于胎齡24周時(shí)形成成熟的腺體，而在成年人的創(chuàng)口愈合處，則不能再生為任何腺體，提示表皮及其附屬腺體的發(fā)育與Wnt-1的表達(dá)有很大的關(guān)系?；诖?，我們?cè)诒菊n題里進(jìn)行了Wnt-1影響人表皮干細(xì)胞分化與增殖的相關(guān)研究。 在本課題中，我們基于“結(jié)構(gòu)決定功能”的思想，首先以生物信息學(xué)的手段和方法，對(duì)Wnt-1進(jìn)行氨基酸序列分析、

3、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測和理化性質(zhì)分析，以期獲得對(duì)Wnt-1的分子水平的了解。在研究Wnt-1對(duì)人表皮干細(xì)胞的分化與增殖的影響時(shí)，我們借助了重組腺病毒基因?qū)爰夹g(shù)將Wnt-1導(dǎo)入到人表皮干細(xì)胞內(nèi)。這是因?yàn)閃nt-1是一種不穩(wěn)定蛋白，在生理?xiàng)l件下極易降解，添加外源性Wnt-1蛋白至細(xì)胞培養(yǎng)基中，難以維持其濃度的穩(wěn)定，且會(huì)增加組間誤差和組內(nèi)誤差。在人表皮干細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Wnt-1蛋白前后，我們檢測了其增殖能力、標(biāo)記性分子、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和：MMP

4、-7濃度、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度等多項(xiàng)指標(biāo)，以研究Wnt-1對(duì)人表皮干細(xì)胞分化與增殖的影響。 第一部分：Writ-1的生物信息學(xué)分析 目的：全面分析Wnt-1蛋白的生物信息學(xué)特征 方法：首先，從NCBI上摘錄Wnt家族的全部氨基酸序列，以Phylip和Treeview軟件繪制該家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹；然后，以ExPASY網(wǎng)站提供的生物信息學(xué)分析模塊和本地Anthprot生物信息學(xué)分析軟件對(duì)Wnt-1的氨基酸組成成分、等電點(diǎn)

5、、信號(hào)肽切割位點(diǎn)、滴定曲線等進(jìn)行分析；以GOR4、HNN、SOPMA三種方法預(yù)測Wnt-1的二級(jí)結(jié)構(gòu)；以ExPASY網(wǎng)站相關(guān)模塊分析Wnt-1的親水性、極性以及折返系數(shù)；最后對(duì)這些結(jié)果進(jìn)行比對(duì)和分析。 結(jié)果：Wnt家族中，Wnt-4、Wnt-11和Wnt-16單獨(dú)存在，其他的成員均成對(duì)存在；Wnt-1與Wnt-6配對(duì)，二者親緣關(guān)系最近。Wnt-1整體略帶正電荷；不穩(wěn)定指數(shù)為62.61，為一種不穩(wěn)定蛋白；整體親水性指數(shù)為.-0.3

6、47，為一種疏水性蛋白；等電點(diǎn)約在9.0附近；信號(hào)肽為一條含27個(gè)氨基酸的短肽。GOR4、HNN、SOPMA三種二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測方法均認(rèn)為Wnt-1的第25～50、112～172、222～238、272～360位區(qū)域主要由不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)和伸展結(jié)構(gòu)所構(gòu)成。親水性、極性以及折返系數(shù)分析結(jié)果均提示：第59～69、89～102、150～160、175～195、209～220、335～342位區(qū)域的量化指標(biāo)高于閾值。 結(jié)論：Wnt-1與Wnt

7、-6配對(duì)存在；Wnt-1在生理?xiàng)l件下不穩(wěn)定；Wnt-1蛋白第150～160和335～342兩個(gè)區(qū)域既符合功能結(jié)構(gòu)域的空間構(gòu)成要素，又符合理化構(gòu)成要素，最有可能成為其功能結(jié)構(gòu)域。 第二部分：Writ-1重組腺病毒的構(gòu)建 目的：構(gòu)建Wnt-1重組腺病毒顆粒 方法：從其他研究者取得已經(jīng)構(gòu)建好的，經(jīng)測序證實(shí)序列無誤的重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV/Wnt-1，將其線性化后在BJ5183細(xì)菌中和腺病毒骨架質(zhì)粒pAdE

8、asy-1重組，構(gòu)建成重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-1/Wnt-1；使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-1/Wnt-1導(dǎo)入QBI-293A細(xì)胞中，借助該細(xì)胞中提供的反式補(bǔ)償，產(chǎn)生具有普遍感染能力的pAdEasy-1/Wnt-1重組腺病毒顆粒。最后，對(duì)這些病毒顆粒進(jìn)行大量擴(kuò)增，以滿足下一步實(shí)驗(yàn)之用。 結(jié)果：重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-1/Wnt-1構(gòu)建完成后，以PacI酶切后，可見一條遠(yuǎn)大于15Kb的明亮條帶和一

9、條約4.5Kb的條帶，與理論值完全吻合，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功；以該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞后，可觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，證明產(chǎn)生了攜帶Wnt-1重組穿梭質(zhì)粒的腺病毒顆粒；經(jīng)大量擴(kuò)增，最終獲得足夠的pAdEasy-1/Wnt-1重組腺病毒顆粒。 結(jié)論：Wnt-1重組腺病毒顆粒構(gòu)建成功。 第三部分：Wnt-1對(duì)人表皮干細(xì)胞分化與增殖的影響的研究 目的：研究Wnt-1對(duì)人表皮干細(xì)胞分化與增殖的影響 方法：

10、首先，以Ⅳ型膠原快速粘貼法獲得人表皮干細(xì)胞，并借助重組腺病毒技術(shù)將Wnt-1基因?qū)肴吮砥じ杉?xì)胞；隨后觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，并以RT-PCR法檢測Wnt-1mRNA在人表皮干細(xì)胞中的存在；最后以CASYexcell系統(tǒng)檢測人表皮干細(xì)胞的增殖能力，以免疫組化法檢測角蛋白K5、K6、K7、K8、K10、K18、K19以及CD44、CEA、ER、PR等標(biāo)記性分子的表達(dá)，以ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-7的濃度

11、，以激光共聚焦技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。 結(jié)果：分離獲取的人表皮干細(xì)胞在接種后第4天進(jìn)入快速生長期，第8天時(shí)到達(dá)平臺(tái)期；Wnt-1基因?qū)肴吮砥じ杉?xì)胞后，可觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，RT-PCR也檢測到了Wnt-1mRNA的存在，故以雙重標(biāo)準(zhǔn)證明了Wnt-1基因在人表皮干細(xì)胞中的存在與表達(dá)；CASYexcell系統(tǒng)檢測后發(fā)現(xiàn)，人表皮干細(xì)胞直徑無明顯變化，而細(xì)胞增殖則明顯加強(qiáng)；人表皮干細(xì)胞角蛋白K10的表達(dá)由陰性變?yōu)殛栃?，K18