煙草碳酸酐酶基因的克隆及其生物信息學(xué)分析.pdf

1、綠色植物光合作用是在可見光照射下，葉綠素將CO2和H2O轉(zhuǎn)化為有機物，并釋放O2的化學(xué)過程。光合作用就是積蓄能量和形成有機物的過程。這個過程對于整個生態(tài)界的碳循環(huán)來說是必不可少的，是作為植物生存的關(guān)鍵存在的。實驗前期以不同主產(chǎn)區(qū)的云煙87煙草葉片作為試驗材料，采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法，對宜賓、廣元、西昌和米易四個具有代表性的特色烤煙生態(tài)區(qū)進行了煙葉蛋白質(zhì)組學(xué)研究，探索了不同生態(tài)區(qū)煙葉的蛋白質(zhì)組差異。米易生態(tài)區(qū)煙葉在SDS-PAGE電泳時在

2、蛋白質(zhì)Marker指示的17KDa大小左右出現(xiàn)明顯差異條帶。之后又在雙向電泳中鑒定出差異條帶中包含五種蛋白，它們分別是磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶、細(xì)胞色素、硫氧還蛋白、泛素和碳酸酐酶。比較發(fā)現(xiàn)碳酸酐酶(CA)是一種與光合作用相關(guān)的酶，針對于碳酸酐酶(CA)的文獻中研究發(fā)現(xiàn)，大豆、玉米和水稻植物的碳酸酐酶活性與其凈光合速率之間都呈顯著相關(guān)，碳酸酐酶活性的高低對凈光合速率都有較大影響，然而在煙草中與碳酸酐酶相關(guān)的研究報道較少。本研究克隆了前期

3、試驗發(fā)現(xiàn)的差異條帶中的碳酸酐酶基因，并對該基因進行了生物信息學(xué)和功能分析。主要研究如下:
　　(1)通過同源克隆法，從煙草NbCA同源克隆NtCA基因，利用生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)開放閱讀框為525bp，編碼174個氨基酸，一個β碳酸酐酶結(jié)構(gòu)域，屬于β碳酸酐酶?？寺『鬁y序序列通過在線NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST同源性分析，發(fā)現(xiàn)該基因序列與煙草NsCA有97％相似度;馬鈴薯StCA有90％的相似度;與番茄LpCA有89％的相似度;與芝麻

4、SiCA有78％的相似度?？寺⌒蛄信c其它學(xué)者登錄的CA序列基本一致，說明在同種植物中該基因保守程度非常高。
　　(2)對CA蛋白進行理化性質(zhì)分析，蛋白理論等電點為5.91，CA蛋白分子量為34.51KD，化學(xué)式為C858H1334N222O248S9，不穩(wěn)定指數(shù)為55.11，半衰期為30h，脂肪族指數(shù)為95.25，總平均疏水性（GRAVY）為0.262，由GRAVY可知，煙草CA蛋白GRAVY值在2和-2之間，且為正值，則此CA蛋

5、白為疏水性蛋白。
　　(3)利用IBCP的在線工具SOPMA對碳酸酐酶的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，得出結(jié)果為:該酶蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由63個氨基酸殘基構(gòu)成占29.72％的α-螺旋(alpha helix)，62個氨基酸殘基形成占29.25％的無規(guī)則卷曲(randomcoil)、延伸鏈占(extended strand)27.83％，由少量的氨基酸殘基構(gòu)成β-轉(zhuǎn)角(beta turn)占13.21％。利用同源性建模法構(gòu)建的煙草碳酸酐酶三維結(jié)