大豆C4H基因克隆及生物信息學(xué)分析.pdf

1、大豆（Glycine max（L.）Merr.）是我國(guó)重要的糧食和油料作物，含有豐富的蛋白質(zhì)和脂肪，綜合利用價(jià)值高，而因?yàn)橹赜鐔?wèn)題引起了嚴(yán)重的連作障礙，導(dǎo)致大豆抗逆性降低，產(chǎn)量大幅度下降。近年來(lái)，研究表明次生代謝產(chǎn)物的化感效應(yīng)也是引起連作障礙的重要原因之一，同時(shí)次生代謝已成為植物分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。苯丙烷代謝途徑是植物最重要的次生代謝途徑之一。肉桂酸-4-羥基化酶（C4H，EC1.14.13.11），又稱(chēng)反式肉桂酸-4-單氧化酶

2、，催化肉桂酸羥化作用產(chǎn)生4-香豆酸鹽，是苯丙烷途徑中繼L-苯丙氨酸解氨酶（PAL）之后的第二個(gè)關(guān)鍵酶。為了從分子水平上揭示大豆C4H的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并為提高其表達(dá)活性提供理論依據(jù)，本研究以大豆綏農(nóng)14為材料，利用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行大豆肉桂酸-4-羥基化酶基因mRNA（C4HmRNA）；利用PCR技術(shù)進(jìn)行大豆肉桂酸-4-羥基化酶基因組基因（C4HDNA）的分離克隆并結(jié)合RACE技術(shù)進(jìn)行C4H基因3’末端基因的克隆。在此基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)

3、手段對(duì)C4HmRNA推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行主要結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測(cè)。通過(guò)上述研究得到以下結(jié)果：
　　 利用RT-PCR方法成功地從大豆葉片中克隆了肉桂酸-4-羥基化酶基因mRNA（C4HmRNA）（登錄號(hào)為FJ770468）。獲得的C4H mRNA基因長(zhǎng)度為1766bp，編碼區(qū)1521bp，與已公布的C4H mRNA序列（登錄號(hào)為X92437）的編碼區(qū)相似性達(dá)98.77％，兩者只有1個(gè)堿基的差異（位于1237位的堿基），并與其它植

4、物的該基因序列具有同源性，應(yīng)用NCBI上的BlastX工具將C4H cDNA的測(cè)序結(jié)果推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)序列與已知的C4H蛋白質(zhì)序列（登錄號(hào)為Q42797）比較，相似性達(dá)99.80％，兩者只有1個(gè)氨基酸的差異（位于396位的氨基酸），編碼一個(gè)含有506個(gè)氨基酸殘基的多肽。
　　 運(yùn)用PCR擴(kuò)增技術(shù)首次克隆了大豆肉桂酸-4-羥基化酶基因組基因C4HDNA（登錄號(hào)為HM036117）。測(cè)序結(jié)果表明，C4H DNA含有1個(gè)外顯子，無(wú)內(nèi)含子

5、，外顯子序列與獲得的C4H mRNA序列完全一致。
　　 結(jié)合RACE技術(shù)克隆了大豆C4H基因3’末端序列，并將登錄號(hào)為FJ770468的大豆C4H基因mRNA升級(jí)到FJ770468 updata，長(zhǎng)度為1799bp。
　　 用ExPasy軟件包和TOPPRED在線分析C4H的理化特性，結(jié)果表明C4H的理論等電點(diǎn)PI=5.30，Mw=39092；C4H是易溶、親水性較強(qiáng)的蛋白，同時(shí)有兩個(gè)明顯的疏水峰，有2個(gè)跨膜肽段；并運(yùn)

6、用DNAMAN6.0軟件構(gòu)建了C4H的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。通過(guò)HNN分析二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，C4H的α螺旋（Alpha helix）（Hh）：251，49.60％，β折疊（Extended strand）（Ee）：52，10.28％，無(wú)規(guī)卷曲（Random coil）（Cc）：203，40.12％；Geno3d模建預(yù)測(cè)，C4H蛋白中β折疊區(qū)有57個(gè)折疊，折疊區(qū)間有24為個(gè)α螺旋，此外還有14個(gè)卷曲結(jié)構(gòu)。氨基酸序列和結(jié)構(gòu)分析顯示C4H蛋白包含了