青稞C4H基因的克隆與組織表達分析.pdf

1、青稞(Hordeum vulgareL.var.nudum Hook.f)即裸大麥，是營養(yǎng)豐富的糧食作物，不僅富含蛋白質和膳食纖維，更含有黃酮類化合物、γ-氨基丁酸等活性功能成分，其保健和醫(yī)療作用一直是大麥工作者研究的重點。黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌抗腫瘤、延緩衰老、保護心腦血管等多種藥理功能，是人們理想的保健物質，植物中的天然黃酮類化合物主要有黃酮、黃酮醇、黃烷酮、異黃酮等十幾類，大麥中的黃酮類物質以黃酮醇為主。苯丙烷代謝途徑是植物

2、最重要的次生代謝途徑之一，其公共苯丙氨酸途徑下游的黃酮支路是植物黃酮合成的重要方式。
　　肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)是苯丙氨酸途徑第二步的關鍵酶，也被認為是該途徑的限速酶，它作為細胞色素P450酶蛋白家族參與苯丙烷代謝途徑的第一個成員，高效地催化苯丙烷代謝途徑中的第一個氧化反應:在O2和NADPH存在下將反式肉桂酸苯環(huán)的C4位羥基化生成對-香豆酸。為從分子水平了解青稞黃酮代謝途徑相

3、關基因的作用，使用RT-PCR結合同源克隆與RACE技術，用青稞材料“94-19-1”首次克隆出青稞肉桂酸-4-羥化酶(HvC4H)基因的cDNA全長序列，并使用實時熒光定量PCR對其在青稞胚乳發(fā)育5個時期里不同組織（子粒、莖部和葉片）中的表達水平進行了相對定量分析。
　　主要結果如下:
　　1.根據NCBI數據庫里已知的禾本科單子葉植物C4H基因序列，通過序列比對在保守區(qū)域設計一對簡并引物，同源克隆得到HvC4H基因的保守

4、片段。在保守片段的基礎上，采用RACE技術分別擴增出HvC4H基因的3'端和5'端序列并由序列拼接得到cDNA全長。結果表明，青稞肉桂酸-4-羥化酶基因的cDNA長為1951 bp，開放閱讀框(ORF)為1518bp(125-1642)，共編碼505個氨基酸;5'端非編碼區(qū)(5'-UTR)為124bp，3'端非編碼區(qū)(3'-UTR)為309bp并包含了27bp的Poly-A尾。
　　2.Blast序列比對結果顯示，HvC4H基因與

5、二穗短柄草C4H基因相似度最高，為94％，與綠竹筍、柳枝稷、慈竹、粟米等C4H基因的相似度在92％，與水稻、玉米、垂尾桉、高粱等C4H基因的相似度在82％以上。HvC4H氨基酸序列包含了其CYP450酶蛋白家族已知的保守域和特征基序，包括血紅素結合域、5個特征性底物識別基序、脯氨酸鉸鏈基序等，同時也識別到C4H區(qū)別于其它CYP450蛋白的特有的氨基酸活性位點。
　　3.采用實時熒光定量PCR技術，以在大麥胚乳發(fā)育期表達穩(wěn)定的β-a

6、ctin和α-tubulin基因為內參，檢測了HvC4H基因在青稞胚乳發(fā)育5個時期里子粒、莖部和葉片中的表達水平。結果顯示，HvC4H基因在青稞胚乳發(fā)育各個時期的子粒、莖部和葉片中的表達存在明顯的組織和時空差異性。莖部中的表達量剛開始最高，4天后急劇降低;葉片中的表達量在第8天達到最高;子粒中的表達量不高，但每個時期的差距較小?？偟目磥恚谡麄€胚乳發(fā)育期，莖中HvC4H基因的表達量相對較高，而子粒中HvC4H基因的表達較低但保持穩(wěn)定水平