青稞blt基因和HVA1基因的克隆和序列分析.pdf

1、青稞（Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.f.），屬禾本科大麥屬，在植物學上屬于栽培大麥的變種，因其成熟時籽粒內(nèi)外稃與穎果分離，籽粒裸露，故稱裸大麥。青稞是青藏高原一年一熟的高寒農(nóng)區(qū)的標志性作物，由于青藏高原高寒缺氧、降雨量少、蒸發(fā)量大等惡劣的氣候環(huán)境，低溫和干旱成為制約青稞品質(zhì)和產(chǎn)量提高的重要因素。雖然生長環(huán)境惡劣，青稞仍然表現(xiàn)出對逆境很強的適應性，因而蘊藏了十分豐富的與抗逆相關(guān)的優(yōu)良基因。從這些優(yōu)良基因

2、中挖掘耐旱和耐寒相關(guān)基因以及對其功能進行分析對青稞的耐逆境脅迫機理研究和品種耐逆性遺傳改良的研究具有重要意義。
　　為了了解blt4.9和HVA1基因在青稞中的功能，本實驗以青稞品種“昆侖12號”為材料，分別克隆了耐寒基因blt4.9和耐旱基因HVA1，并通過Real-timePCR檢測了兩個基因在不同逆境脅迫時間下的表達量；成功構(gòu)建了植物表達載體1301-blt4.9和1301-HVA1，為下一步的轉(zhuǎn)基因奠定了理論基礎。具體結(jié)果

3、如下：
　?。?）blt4.9基因全長738bp，其中包括348bp的開放閱讀框，編碼115個氨基酸，相對分子質(zhì)量11.2kD，理論pI值9.04，不穩(wěn)定系數(shù)28.41，是一個穩(wěn)定的蛋白質(zhì)；該蛋白富含Ala、Ser、Val、Gly等氨基酸，不含Trp、Glu和Phe氨基酸，這和已報道的其他冷誘導基因的氨基酸組成相似；二級結(jié)構(gòu)預測得到blt4.9基因編碼的蛋白質(zhì)含有大量α螺旋（48.7％），從第5-29個氨基酸有一個跨膜蛋白；總平均

4、親水性0.597，是一個高度疏水性蛋白質(zhì)；序列比對顯示該基因編碼的氨基酸和大麥LTP家族基因有高度同源性，和粳稻的同源性較遠。通過Real-timePCR檢測了blt4.9基因在低溫（4℃）不同脅迫時間下的表達量，用雙標準曲線法和SPSS分析結(jié)果得到隨著脅迫時間的增加，blt4.9基因的表達量逐漸增加，且12h、24h和48h的表達量與對照（0h）差異顯著（p＜0.05）。用BamHI和SacI兩個內(nèi)切酶分別酶切質(zhì)粒blt4.9-T和p

5、CAMBIA1301，將blt4.9基因插入pCAMBIA1301多克隆位點中，成功構(gòu)建了1301-blt4.9植物表達載體，為青稞遺傳轉(zhuǎn)化和抗寒分子設計育種的研究奠定了基礎。
　?。?）HVA1基因全長695bp，其中包括642bp的開放閱讀框，編碼213個氨基酸，相對分子質(zhì)量21.8kD，理論pI值9.04，不穩(wěn)定系數(shù)17.09，是一個穩(wěn)定的蛋白質(zhì)；其中Ala、Thr、Lys三種氨基酸最多，超過總蛋白含量的52%；二級結(jié)構(gòu)預測

6、得到HVA1基因編碼的蛋白質(zhì)含有大量α螺旋（77%），總平均親水性-1.048，是一個高度親水無跨膜蛋白的小分子量蛋白質(zhì)。序列比對顯示，HVA1基因與大麥的HVA1基因同源性最高，達到99.5%。通過Real-timePCR檢測HVA1基因在干旱不同脅迫時間下的表達量，用雙標準曲線法和SPSS分析，結(jié)果表明，隨著干旱脅迫時間的延長，HVA1基因表達量逐漸增加，8h和12h的表達量比0h明顯增加，且差異顯著（p＜0.05）。最后，用Bam