禽呼腸孤病毒L1和L3基因的克隆與序列分析.pdf

1、本試驗(yàn)參考禽呼腸孤病毒S1133株L1基因序列(GenBank)，禽呼腸孤病毒1733株L3基因序列(GenBank)分別設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，以禽呼腸孤病毒內(nèi)蒙古分離株C-98株和天津分離株T-98株提取的總RNA為模板，采用RT-PCR方法分別擴(kuò)增L1基因和L3基因的eDNA，獲得的cDNA連接到PMD19-T載體中，并進(jìn)行克隆，經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶切鑒定后的陽(yáng)性重組質(zhì)粒送寶生物(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)定的序列進(jìn)行拼接，結(jié)果顯

2、示:L1基因eDNA全長(zhǎng)3959bp，包含一個(gè)由3882bp組成的完整開放閱讀框，共編碼1293個(gè)氨基酸，且在5'端和3'端分別有21bp和56bp組成的非編碼區(qū):L3基因eDNA全長(zhǎng)3907bp，包含一個(gè)由3858bp組成的完整開放閱讀框，共編碼1285個(gè)氨基酸，在5'端和3'端分別有12bp和37bp組成的非編碼區(qū)，且序列已遞交于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，登錄號(hào)分別為C-98(L1基因:EU616735；L3基因:EU616737);

3、T-98(L1基因:EU616739；L3基因:EU616738)。序列同源性比較分析結(jié)果表明:C-98與T-98在L1和L3基因核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸都有著很高的同源性，為99.8％，99.9％:C-98和T-98與其它12株禽呼腸孤病毒分離株相比較，L1基因核苷酸同源性在85.4％～99.8％，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性在96.4％～99.8％:L3基因核苷酸同源性在72.6％～99.9％，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性在83.1％～99.8％

4、。C-98和T-98 L1基因與3株哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒分離株L3基因核苷酸同源性在43.9％～44.5％，其推導(dǎo)的氨基酸序列同源性在43.0％～43.2％；C-98和T-98 L3基因與3株哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒L2基因核苷酸同源性在4.7％～5.0％，其推導(dǎo)的氨基酸序列同源性在26.6％～27.4％。進(jìn)化樹分析顯示:L1基因分出4個(gè)不同的譜系，L3基因分出3個(gè)不同的譜系，且各譜系之間與致病性、血清型和分離地區(qū)沒有相關(guān)性，但是C-98、T-

5、98、S1133、1733、2408、919和T6始終在L1基因和L3基因進(jìn)化樹的同一個(gè)譜系中。氨基酸序列分析表明:C-98和T-98及12株參考毒株在L1基因靠近N末端有一個(gè)獨(dú)特的親水區(qū)，位于1aa～110aa，在親水區(qū)內(nèi)還存在一個(gè)可變區(qū)，位于19aa～51aa，在肽鏈的182aa～202aa位存在一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)基序C2H2；L3基因在169aa與188aa位點(diǎn)有鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶(即加帽酶)所必需的賴氨酸(tys)殘基，822aa-830a