大腹園蛛拖絲蛋白基因的克隆和序列分析.pdf

1、蜘蛛可產(chǎn)生七種絲和膠粘物,其化學(xué)本質(zhì)均為蛋白質(zhì)。其中蜘蛛拖絲將高強(qiáng)度和高彈性集于一體,是最優(yōu)良的天然蛋白質(zhì)纖維,被譽(yù)為“生物鋼”。在蜘蛛拖絲蛋白質(zhì)的氨基酸序列中有四個特征性的氨基酸序列motifs,這四個氨基酸序列motifs以多個數(shù)量、多種組合和多次重復(fù)的形式存在。由于構(gòu)成蜘蛛拖絲蛋白基因的核苷酸序列高GC含量(局部區(qū)域可達(dá)80％),且具有大量的重復(fù)性序列,因而以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增或以mRNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增拖

2、絲蛋白基因時,設(shè)計(jì)特異性引物是相當(dāng)困難的,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物極易出現(xiàn)梯形的多條DNA帶。實(shí)際擴(kuò)增中由于模板和引物的競爭作用,使得基因擴(kuò)增提前終止,只能得到較短的DNA片段,因而到目前為止,編碼蜘蛛拖絲蛋白基因的大小尚未確定,尚未獲得編碼蜘蛛拖絲蛋白基因的完整克隆,蛋白表達(dá)的研究也進(jìn)展緩慢。任洪林等采用構(gòu)建cDNA文庫的方法僅獲取了大腹園蛛拖絲蛋白約1.7kb的部分編碼序列;Beckwitt等進(jìn)行PCR擴(kuò)增雙世紀(jì)園蛛的基因組DNA,僅獲得了約

3、300bp和700bp的拖絲蛋白基因片段。本論文選取大腹園蛛作為研究對象,解剖分離出大腹園蛛主壺腹腺體,提取基因組DNA和總RNA,設(shè)計(jì)合成了很多對引物,采用常規(guī)PCR、多重PCR、熱啟動PCR等方法進(jìn)行擴(kuò)增,并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終確定了長距離PCR反應(yīng)對復(fù)雜基因的擴(kuò)增。通過多種引物對實(shí)驗(yàn)、MgCl2濃度梯度實(shí)驗(yàn)、引物濃度梯度實(shí)驗(yàn)、退火溫度梯度實(shí)驗(yàn)、延伸時間梯度實(shí)驗(yàn)、touch down循環(huán)等實(shí)驗(yàn)對PCR以及RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,以

4、擴(kuò)增大腹園蛛拖絲蛋白基因。凝膠純化、回收擴(kuò)增獲得的大腹園蛛拖絲蛋白基因DNA,克隆于pDrive載體,篩選轉(zhuǎn)化子,并經(jīng)PCR、酶切和序列分析鑒定陽性克隆。將其中的一個克隆基因片段構(gòu)建入pET32a(+)蛋白表達(dá)載體。本論文以DNA為模板,通過PCR擴(kuò)增獲得了編碼大腹園蛛拖絲蛋白基因的克隆AvDS1,序列長2199bp,序列分析表明不含基因內(nèi)含子;通過RT-PCR,獲得了編碼大腹園蛛拖絲蛋白基因的克隆AvRS2,序列長951bp;序列比較

5、分析推測大腹園蛛拖絲蛋白基因存在著兩種組分,AvRS2克隆為編碼大腹園蛛拖絲蛋白基因組分-1,AvDS1克隆可能為大腹園蛛拖絲蛋白基因的另一組分-2。獲得了可以表達(dá)大腹園蛛拖絲蛋白基因AvRS2的pET-RS2表達(dá)載體。這些成果有助于進(jìn)一步研究大腹園蛛拖絲蛋白基因的基因組成和結(jié)構(gòu)特征、為應(yīng)用蛋白質(zhì)剪接技術(shù)開發(fā)蜘蛛拖絲蛋白的研究提供了基因克隆,構(gòu)建的表達(dá)載體為進(jìn)一步研究蜘蛛拖絲蛋白基因的表達(dá)、表達(dá)蛋白的結(jié)構(gòu)以及應(yīng)用表達(dá)蛋白進(jìn)行人工紡絲奠定