小麥WOX基因的克隆與表達分析.pdf

1、本研究以小麥及其近緣屬作為研究材料，通過同源克隆，熱不對稱交錯PCR及RT-PCR等方法，成功分離得到WOX2和WOX5s基因序列，并對TaWOX2和TaWOX5s基因的表達及功能進行了研究，了解它們在小麥胚胎發(fā)生過程中的作用。本研究主要結(jié)果如下:
　　1.克隆得到了小麥WOX2基因序列，全長為2045bp，編碼區(qū)長度為969bp，編碼322個氨基酸殘基。在氨基酸水平上進行序列比對發(fā)現(xiàn)，小麥WOX2與OsWOX2和ZmWOX2A的

2、homeodomain區(qū)域相似性達89.6％和85.1％，并且該基因序列具有WOX家族現(xiàn)代進化支的2個保守結(jié)構(gòu)域，homeodomain和WUS-box。據(jù)此認為，克隆到的序列編碼小麥WOX2蛋白，命名為TaWOX2。
　　2.克隆得到了小麥WOX5基因序列，序列分析的結(jié)果表明WOX5基因分為三種等位變異類型，全長分別為1038bp、1029bp和1032bp，編碼區(qū)長度分別為639bp、630bp和633bp，編碼209-212

3、個氨基酸殘基。將克隆得到的序列與水稻和玉米WOX5蛋白序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)TaWOX5a與OsWOX5和ZmWOX5B的相似性分別是78.8％和65.5％，并且TaWOX5s的homeodomain區(qū)域氨基酸序列與水稻玉米的該區(qū)域完全一致。TaWOX5s具有WOX家族現(xiàn)代進化支的3個保守結(jié)構(gòu)域，分別是homeodomain、WUS-box和EAR-like。據(jù)此認為，克隆到的序列編碼小麥WOX5蛋白，分別命名為TaWOX5a，TaWO

4、X5b和TaWOX5c。在小麥近緣屬材料中克隆到的WOX5基因高度同源，只存在兩個位點的插入缺失變異。
　　3.分別將TaWOX2和TaWOX5c分別連入原核表達載體pET-30a，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)基因成功表達，得到約34kDa和26kDa的重組蛋白。重組蛋白的分子量大小與核酸序列預(yù)測結(jié)果一致，表明克隆到的序列準(zhǔn)確代表了該基因的開放閱讀框。
　　4.通過熒光定量PCR分析了這兩個基因在普通小

5、麥中的表達模式，TaWOX2主要在種子發(fā)育過程中表達，TaWOX2在種子發(fā)育過程中的表達水平很有可能反映了其在胚發(fā)育過程中的表達水平，因此，推測TaWOX2基因和小麥的胚發(fā)育相關(guān)。Ta WOX5主要在根和愈傷組織中表達，在愈傷組織中，TaWOX5s在2，4-D的誘導(dǎo)下表達量逐漸升高，而在NAA，6-BA，玉米素和激動素的誘導(dǎo)下表達量降低。因此，推測TaWOX5s可能與小麥根的形成和發(fā)育有關(guān)，并且TaWOX5的表達受生長素和細胞分裂素的調(diào)